Protein Bioconjugatlar sentezi<em> yoluyla</em> Sistein-maleimid Kimya
Summary
Bu protokol, reaktif saflaştırma, reaksiyon koşulları, Bioconjugate saflaştırma ve Bioconjugate karakterizasyonu dahil olmak üzere, bir maleimid proteini ihtiva eden bir sisteinin bioconjugation için gerekli olan önemli adımlar göstermektedir.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugation kovalent bir boya, bir ilaç veya bir polimer gibi bir sentetik molekülü bir ya da sadece bir biyomolekülün bağlantı içerir. Protein bioconjugation yöntemleri artık yoğun protein yapma, floresan boya etiketleme 1,2 arasında değişen uygulamalarla birçok kimya, biyoloji ve nanoteknoloji araştırma gruplarında kullanılan (antikor) 3 (antikor ilaç konjugatları – ADK) -prodrugs protein dimerleri 4,5 sentezini , nanotıp 8 ve sistemler kimya 9 kullanılan kendinden montaj protein polimer melezler 6,7 kadar.
kimya Özelliği, her zaman kritik olmasa da, hedef proteinin aktif site ile müdahale etmeyecek şekilde, en fonksiyonel proteini biyokonjugatlar için büyük önem taşımaktadır, bioconjugation kullanılır. Ilgilenilen protein i) hedefleme nadir veya benzersiz siteler: İdeal bioconjugation reaksiyonu da dahil olmak üzere, çeşitli kriterleri yerine getirmek gerekiyorii) iii) açılımı protein önlemek için denatüre edici olmayan koşullar altında devam, bu hedefe yönelik seçici olmak ve hedef protein genellikle alt milimolar konsantrasyonda kullanılabilir olarak iv) yüksek verimli olacak. Maleimid – sistein Michael katılması, tüm bu kriterlere uygun yakın geliyor ve bu nedenle uzun Bioconjugate Chemistry 10 alanında özel bir statüye iddia için vardır. i) kendi yüzeyi üzerinde tek bir sistein kalıntısı ihtiva eden bir çok protein, genetik doğru pH Reaksiyon sistein karşı yüksek oranda seçicidir ii) vardır tasarlanmış olabilir, çünkü bu, iii), sulu tamponlar içinde düzgün bir şekilde devam eder ve iv) çok hızlıdır bazı durumlarda, 11 5000 M-1 sn-1 aşan bildirilmiştir sistein içeren proteinlere maleimid ikinci dizi oranı sabiti ile. 12 ilgilenilen protein organik bir küçük (≈% 5-10) miktarı tolere edebilir sağlanan eş-çözücü, hemen hemen her maleimid fonksiyonlu boya, polymer, yüzey veya başka bir protein, protein ile bağlantılı olabilir. Buna ek olarak, maleimitler, yüksek pH diğer nükleofillerle reaksiyona daha yatkındır iyodoasetamid, daha proteinler üzerinde sistein daha özel olarak; ve disülfid değişim 13 önlemek için asidik pH değerinde tutulması gerekir disülfid tabanlı çekimleri daha kararlı.
Burada, bir Ru (ll) tabanlı kromofor ve örnek olarak redoks proteini sitokrom c arasındaki reaksiyonu kullanarak tek bir sistein kalıntısı ihtiva eden bir proteine maleimid işlevselleştirilmiş moleküllerin bağlanması için genel bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, erişilebilir bir yüzeye sistein kalıntısı ve karşılık gelen maleimid-işlevselleştirilmiş bir hedef içeren, başka proteinler için de geçerlidir, bu bir protein, bir floresan boya, bir kromofor veya sentetik polimer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir bioconjugation önce başlangıç malzemelerinin saflaştırılması büyük önem taşımaktadır. Ticari rekombinan kaynaklardan elde edilen proteinler, sıklıkla farklı yüzey kimya ve reaktiviteye sahip, ilgilenilen protein, diğer izoformları içerir. Örneğin, tarif edilen bioconjugation olarak, ticari olarak temin edilebilir Cyt Cı iki izo-1 ve izo-2 Cyt C 12,14,17 oluşan bir karışımı içerir. İzo-2 ve izo-1 sitokrom c formları temel fark, izo-1 sitokrom…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates–synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
