טכניקה Swiss-מתגלגל משופר עבור הכנת רקמת המעי עבור immunohistochemical ו ניתוח Immunofluorescent
Summary
זיהוי מדויק ומיקום של תאי אפיתל לאורך רירית רירית המעי חיוני להגדיר שושלות תאים שונות. הדמיה תקינה של רקמות מעי היא קריטית לזיהוי דפוסי ביטוי חלבון עם רזולוציה מקסימלית. מחקר זה נועד להתוות שיטות האופטימליות ותנאי רקמות מעי עכבר עיבוד.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
אפיתל יונקי המעי מהווה שכבת תאים אחת עמודים. במעי הדק, תאי שגשוג מתוחמי המאורות בעוד תאים ממוינים לכבוש באזור הסיסי. עם זאת, כי אין villi ב המעי הגס, תאי השגשוג הם נקודה לחלק התחתון של המאורות ותאי בדיל לכבוש את האזור העליון של המאורות. אפיתל המעי עובר חידוש מהיר (כ 3 – 5 ימים), כי הוא מונע על ידי חלוקה רציפה של תאי השגשוג בתוך המאורות. תאי השגשוג של המאורות אינם אוכלוסייה הומוגנית מחולקים נוסף לתוך תאי גזע הגברה במעבר (ת"א) תאים 1. תאי הגזע מתגוררים בתחתית הקריפטה, בתוך 4 הראשונים – התאים 5 מן מאוד תחתון 2. המודל הנוכחי תומך בקיומו של שני סוגים של תאי גזע: עמודי בסיס הקריפטה תאים גזע (CBC) ותאי גזע שקטים מילואים. ה- CBC sתאים TEM הם מתרבים באופן פעיל מסומנים על ידי G- חלבון בשילוב המכילים חוזרים לאוצין עשיר קולטן 5 (Lgr5) 3, 4 Olfactomedin (Olfm4) 4 ו Achaete scute דמוי 2 (Ascl2) 5. מצד שני, תאי גזע שקט מילואים מסומנים על ידי אתר אינטגרציה וירוס לוקמיה בעכברים תא ספציפי B Moloney 1 (Bmi1) 6, טלומרז העכבר הפוכה transcriptase (mTert) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, Doublecortin דמוי קינאז CAM כמו ב- 1 (Dclk1) 9, ו לאוצין-ריץ 'שחוזר אימונוגלובולין-כמו תחומים 1 (Lrig1) 10. תאי הגזע מתרבים באופן פעיל להצמיח תאי ת"א ואז לעבור התמיינות נוספת לתאים קליטים (enterocytes) ותאי הפרשה (enteroendocrine, גביע, פנט, ותאי Tuft). חלוקת תא רציפה באזור שגשוג תוצאת מהלך עליות של תאי אפיתל לאורך ציר מרתף השליה עד שהם מגיעים עליונים של villi, שם הם עוברים אפופטוזיס והםהשליך מעליו מפני השטח של האפיתל. הסוגים השונים של תאי האפיתל במעי מסומנים על ידי הביטוי של חלבונים נפרדים (לדוגמא, תאי גביע במעי יכולים להיות מוכרים על ידי צביעה עם נוגדן נגד תאי Muc2 ו פנט עם נוגדן נגד ליזוזים). אנו ללמוד את התפקיד של Krüppel דמויי גורמים (KLFs) ב הומאוסטזיס pathobiology של האפיתל במעי 11-13. התוצאות המוצגות כאן לתמוך את הכדאיות של טכניקת Swiss-מתגלגל שונה מבוססות על מחקרים קודמים של התפקיד של גורם Krüppel הדמוי 5 (KLF5) בשמירה על תאי הגזע אפיתל במעי מתרבים באופן פעיל 14. KLF5 הוא גורם שעתוק אבץ אצבעות כי מבוטא בכמות גבוהה בגזע המעיים הפעיל ותא ת"א 12. מחקרים קודמים הראו כי KLF5 הוא שיתוף הביע עם Ki-67, סמן שגשוג ידוע מאורות המעיים.
Tr העיכול מעשה אינו רקמות מבנית או תפקודית הומוגנית. המעי הדק מחולק תריסריון, מְעִי צָם, ואת מעי ואת המעי הגס לתוך cecum ומעי גס, עם האחרון נוסף מחולק הפרוקסימלי, אמצע חלקים דיסטלי. לכל אחד מהחלקים הללו תכונות היסטולוגית ייחודיות והיא ממלאת תפקידים ברורים 15. ככזה, את ההשפעות של עלבונות ואת מידת התגובה של האפיתל במעי תלויה באזור של רקמה למדה 16. בנוסף, זני עכברים שונים להפגין מגוון של התגובה ברמה היסטולוגית בהתאם לסוג של עלבון השתמש במחקרים 16. לכן, כיאה הכנת רקמה יש צורך להתיר היסטולוגית מתאים וניתוח מולקולרי של רקמות מעי. ככזה, ניתוח מענקי טכניקה-רולדה של האורך המלא של האפיתל במעי בבת אחת ובכך הוכיח מסקנות מושכלות על בסיס מידע רחב.
e_content "> הטכניקה-רולדה הוזכר לראשונה על ידי מגנוס 17, ותיאר בפרוטרוט על ידי Moolenbeck ו Ruitenberg ופארק et al. כשיטה להכנת רקמות וביצוע היסטולוגית מנתח של המעי מכרסם 18,19, בהתאמה. הפרוטוקול שמסומן בפרסום זה מציג גרסה משופרת של השיטה המקורית המאפשרת עבור הכנת הרקמה עדכני ואמין למטרות אבחון. טכניקה שונה זה מאפשר אוספים והכנת יעיל של האפיתל במעי טכניקות בשימוש אוניברסלית, כגון אימונוהיסטוכימיה, immunofluorescence, כמו גם כמו כלאה באתרו (פלורסנט 20 chromogenic). יתר על כן, הרקמה השונה דגימת שיטת הכנה מנצלת זמינים וזולים יחסית ריאגנטים תוך שהיא מציעה שיטה של קיבעון רקמות מהירה מאפשרת התאוששות של החלבון, DNA, RNA להערכה נוספת. תפוס יחד, תיהטכניקה של מצוין הערכה מקיפה של histopathological, פתולוגי, ומולקולרית תכונות של האפיתל במעי.Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקה מתגלגלת השויצרית היא שיטה חזקה להכנת רקמת מעי להערכה היסטולוגית וצורנית בקנה מידה גדול. בניגוד לטכניקת Swiss-מתגלגלת שתוארה לעיל, אשר פותחה במקור עבור הכנת החלקים קפואים 18,19, הנוהל שהוצג כאן מאפשר הכנת רקמת מעי ללא דיחוי וללא קיבעון קיבעון פורמלין והטבעת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The “Swiss roll”: a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical ‘swiss roll’ method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
