تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي
Summary
التحديد الدقيق والمكان من الخلايا الظهارية على طول بطانة مخاطية الأمعاء ضرورية لتحديد الأنساب مختلفة من الخلايا. التصوير السليم للأنسجة الأمعاء هو أمر حاسم لتحديد أنماط التعبير البروتين مع قرار الحد الأقصى. وتهدف هذه الدراسة لتحديد الأساليب والظروف المثلى لأنسجة الأمعاء معالجة الماوس.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
وتتألف ظهارة الأمعاء الثدييات طبقة واحدة من الخلايا عمودية. في الأمعاء الدقيقة، تقتصر الخلايا التكاثري إلى الخبايا في حين تحتل خلايا متمايزة منطقة زغابة. ومع ذلك، بسبب عدم وجود الزوائد في الأمعاء الغليظة، يتم ترجمة الخلايا التكاثري إلى الجزء السفلي من الخبايا والخلايا المتمايزة تحتل المنطقة العليا من الخبايا. ظهارة الأمعاء يخضع تجديد السريع (حوالي 3-5 أيام) التي يقودها الانقسام المستمر للخلايا التكاثري داخل الأقبية. خلايا التكاثري من الخبايا ليست متجانسة السكان وتنقسم الى مزيد من الخلايا الجذعية و(TA) العبور تضخيم الخلايا 1. الخلايا الجذعية الموجودة في الجزء السفلي من سرداب، خلال أول 4-5 خلايا من الجزء السفلي جدا 2. النموذج الحالي يدعم وجود نوعين من الخلايا الجذعية: الخلايا الجذعية سرداب قاعدة عمودي (CBC) والاحتياطي الخلايا الجذعية هادئة. سي بي سي قخلايا تيم تنتشر بنشاط ويتم وضع علامة كل يسين الغنية التي تحتوي على تكرار G-بروتين بالإضافة مستقبلات 5 (Lgr5) 3، Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 و Achaete ترس مثل 2 (Ascl2) 5. من ناحية أخرى، وصفت الاحتياطي الخلايا الجذعية الساكنة التي كتبها B مولوني الفئران الموقع خلية محددة فيروس اللوكيميا التكامل 1 (Bmi1) 6، التيلوميراز الماوس عكس الناسخ (mTert) 7، HOP علبة مثلية (Hopx) 8، Doublecortin على غرار وكام كيناز تشبه 1 (Dclk1) 9، ويسين الغنية يكرر والمناعي، مثل مجالات 1 (Lrig1) 10. الخلايا الجذعية بنشاط تكاثر تثير خلايا TA ثم الخضوع لمزيد من التمايز إلى خلايا الاستيعابية (المعوية) والخلايا الإفرازية (enteroendocrine، كأس، خلايا بانيت، والخصلة). انقسام الخلايا المستمر في منطقة التكاثري النتائج في الحركة الصعودية للخلايا الظهارية على طول محور سرداب-زغابة حتى تصل إلى أعلى من الزغب، حيث أنها تخضع لموت الخلايا المبرمج، وهيتنفصل عن سطح البشرة. يتم وضع علامة على أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية في الأمعاء عن طريق التعبير عن بروتينات مميزة (على سبيل المثال، الخلايا الكأس المعوية يمكن التعرف عليه بواسطة تلطيخ مع الأجسام المضادة ضد Muc2 وبانيت الخلايا مع الأجسام المضادة ضد الليزوزيم). نقوم بدراسة دور العوامل Krüppel مثل (KLFs) في التوازن والبيولوجيا المرضية من ظهارة الأمعاء 11-13. وتستند النتائج المعروضة هنا تدعم جدوى تقنية السويسري المتداول تعديل على الدراسات السابقة لدور عامل Krüppel مثل 5 (KLF5) في الحفاظ على بنشاط تكاثر الخلايا الجذعية المعوية الظهارية 14. KLF5 هو عامل النسخ الزنك والإصبع التي يتم التعبير غاية في جذع الأمعاء نشطة وخلايا TA 12. وأظهرت دراسات سابقة أن KLF5 وشارك في التعبير عنها كي-67، علامة التكاثري المعروفة في الخبايا المعوية.
آر الهضمي فعل ليس الأنسجة متجانسة من الناحية الهيكلية أو وظيفيا. يتم تقسيم الأمعاء الدقيقة العفج والصائم واللفائفي والأمعاء الغليظة إلى الأعور والقولون، مع مزيد من الأخير ينقسم إلى القريبة والمتوسطة والبعيدة أجزاء. كل من هذه الأقسام لديها ميزات فريدة من نوعها النسيجية ويلعب أدوار متميزة (15). على هذا النحو، وآثار الشتائم ودرجة الاستجابة للظهارة الأمعاء قد تعتمد على المنطقة من الأنسجة درس 16. بالإضافة إلى ذلك، العديد من سلالات الفئران تثبت التنوع في الاستجابة على الصعيد النسيجي على أساس نوع من الإهانة المستخدمة في الدراسات 16. وهكذا، يليق إعداد الأنسجة ضروري للسماح النسيجية المناسبة والتحليل الجزيئي للأنسجة الأمعاء. على هذا النحو، والسويسرية لفة تحليل المنح تقنية طول الكامل للظهارة الأمعاء في وقت واحد، وبالتالي أيقن استنتاجات مطلعة على أساس معلومات شاملة.
e_content "> تقنية السويسري لفة ذكر لأول مرة من قبل ماغنوس 17، ووصف بالتفصيل Moolenbeck وRuitenberg وبارك وآخرون باعتبارها طريقة لتحضير الأنسجة وأداء النسيجية يحلل من القوارض الأمعاء 18،19 على التوالي. البروتوكول المحددة في هذا المنشور تقدم نسخة محسنة من الأسلوب الأصلي الذي يسمح لإعداد الأنسجة في الوقت المناسب وموثوق بها لأغراض التشخيص. وتتيح هذه التقنية المعدلة لمجموعات فعالة وإعداد ظهارة الأمعاء عن التقنيات المستخدمة عالميا، مثل المناعية، المناعي، وكذلك كما (الفلورية ومولد اللون 20) التهجين. وعلاوة على ذلك، والأنسجة تعديل عينة طريقة التحضير تستخدم الكواشف متوفرة وغير مكلفة نسبيا في حين تقدم وسيلة لتثبيت الأنسجة السريع، ويسمح للانتعاش من البروتين، والحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي لتقييم إضافي. المحصلة معا، ثيالصورة التقنية ممتازة لتقييم شامل من المظاهر التشريحية المرضية، المرضية، والجزيئية للظهارة الأمعاء.Protocol
Representative Results
Discussion
تقنية المتداول السويسري هو وسيلة قوية لإعداد الأنسجة المعوية لتقييم النسيجي والصرفي على نطاق واسع. وعلى النقيض من تقنية السويسري المتداول سبق وصفها، والتي وضعت أصلا لإعداد أقسام المجمدة 18،19، الإجراء المقدمة هنا يسمح إعداد الأنسجة المعوية الفوري وتثبيت لتثبي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The “Swiss roll”: a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical ‘swiss roll’ method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
