Method Article

면역 조직 화학적 및 면역 형광 분석을위한 창자 조직 준비를위한 향상된 스위스 압연 기술

DOI:

10.3791/54161

⸱

July 13th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

In This Article

Summary

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정확한 식별 및 장 점막 안감을 따라 상피 세포의 위치는 다른 세포 계보를 정의하는 것이 필수적이다. 장 조직의 적절한 촬상 최대 해상도 단백질 발현 패턴을 식별하기 위해 중요하다. 이 연구는 처리 마우스 장 조직을위한 최적의 방법과 조건을 서술하는 것을 목표로하고있다.

Abstract

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장 상피 항상성을 조절하는 요인의 역할과 부상 및 재생에 대한 반응을 이해하는 것이 중요합니다. 현재 문헌에서는 데이터 검증을 위해 장 조직의 이미지를 얻기 위한 여러 가지 방법론적 접근 방식을 설명합니다. 이 논문에서는 마우스 장 조직의 유도 및 처리와 관련된 일반적인 프로토콜에 대해 설명합니다. 장 조직의 적절한 고정과 장 상피 형태를 향상시키는 스위스 롤 기술에 대해 논의합니다. 절제 후 처리 및 포매된 장 조직의 재배치는 절제 후 온전한 장 구조적 특징을 나타내는 파라핀 포매 블록을 얻는 데 중요합니다. 스위스 롤링 기법은 검사된 전체 장 또는 결장 절편의 조직학적 평가에 도움이 됩니다. 장의 구조적 특징을 구별하는 능력은 전체 길이에 걸친 장 염증 및 종양 형성을 정량적으로 측정하는 데 중요할 수 있습니다. 마지막으로, 파라핀 함유 절편은 면역조직화학 및 면역형광 검출 방법을 모두 사용하는 견고한 공정에 이상적입니다. 비형광 면역조직화학 절편은 다양한 세포 구조적 특징을 자세히 설명하는 조직의 생생한 이미지를 제공하지만 세포 내 공동 국소화 실험에 유연성을 제공하지는 않습니다. 다중 형광 채널은 공동 국소화 실험을 위해 면역형광 검출과 함께 적절하게 활용될 수 있어 기계론적 연구를 지원합니다.

Introduction

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포유류 장 상피 원주 세포의 단일 층을 포함한다. 분화 된 세포가 융모의 영역을 차지하면서 소장에서 증식 세포 지하실에 국한된다. 대장에는 융모 없기 때문에 그러나 증식 세포 지하실의 바닥에 지역화 및 분화 세포 소낭의 상부 영역을 차지한다. 지하실 내 증식 성 세포의 연속 분할에 의해 구동된다 - (5 일 3) 장 상피 신속한 보급을 겪는다. 지하실의 증식 성 세포는 균질 집단 아니며 상기 줄기 세포와 교통 증폭 (TA) 셀 (1)로 세분화된다. 이 바로 아래에서 5 세포 - 줄기 세포는 제 4 내 토굴 하단에 상주. 굴베이스 기둥 (CBC) 줄기 세포 및 예비 정지 줄기 세포 : 현재의 모델은 두 가지 줄기 세포 유형의 존재를 지원한다. CBC의템 세포는 활발하게 증식하고 류신이 풍부한 반복 포함하는 G 단백질 결합 수용체 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 Achaete의 방패 꼴의 뼈 조각 같은 2 (Ascl2) (5)로 표시됩니다. 한편, 예비 정지 줄기 세포는 B 세포 특이 몰 로니 뮤린 백혈병 바이러스 통합 위치 1 (BMI1) 6 마우스 텔로 머라 제 역전사 (mTert) (7)에 의해 표시되어, HOP 호 메....

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Protocol

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1. 마우스

  1. 마우스와 관련된 모든 연구는 스토니 브룩 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 마우스는 12시 12분 시간의 명암주기를 유지 하였다.
    1. 상업적으로 C57BL / 6 마​​우스를 얻을 수 있습니다. 에 loxP 사이트에 의해 형벌 Klf5 대립 유전자 (Klf5 f를 L / F 리터)을 들고 C57BL / 6 마우스를 얻습니다. 이 마우스는 이전에 (21)을 설명하고 우아 박사 료조 나가이에 의해 제공되었다.
  2. Lgr5 프로모터 (Lgr5-EGFP / CreERT2 마우스)의 규정에서 유도 Cre 호텔의 재조합 효소 유전자를 운반하는 C57BL / 6 마​​우스를 구입하십시오.
  3. Lgr5-EGFP / CreER T2 / Klf5 f를 L / f를 리터 마우스를 설정하려면, 교차 Klf5 FL / F Lgr5-EG....

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Results

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면역 조직 화학 염색과 함께 스위스 압연 기술은 작거나 큰 장 조직의 포괄적 인 분석이 가능합니다. C57BL / 6 마우스 (그림 1)의 대장의 H & E 염색의 예는 타당성의 그림과이 기술의 효과이다. 근위, 중간 및 말단도 1에 도시 된 바와 같이, 화상이 대장 모든 부분을 캡쳐 할 수있다. 따라서, 광범위한 조직 학적 평가를 허용한다. 스위스 롤과 크고 작은 창자 조직의 전체 길이를 캡처하는 능력은 이종 유전자 발현 마커 염색 또는 모욕 장 조직의 가변 응답 매우 유용하다.

예 Lgr5-EGFP / CreER T2 마우스에서 EGFP 염색 패턴이다. 이 마우스 모델에서, EGFP의 발현에 의해 구동되고만 활발하게 증식 장 지하실에서 활성 Lgr5 프로모터,.<.......

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Discussion

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스위스의 압연 기술은 대규모 조직 학적 및 형태 학적 평가 소장 조직을 제조하기위한 강력한 방법이다. 원래 동결 절편 (18, 19)의 제조를 위해 개발 된 전술 스위스 압연 기술과는 대조적으로, 여기에서 제시된 방법은 포르말린 고정 파라핀 포함 (FFPE) 조직에 대한 신속한 장 준비 및 고정 할 수있다. 냉동 된 조직과 비교 FFPE 조직 훨씬 긴 수명을 갖고 있기 때문에 더 조직 무결성 조직 학적 분석을 위해 조직의 바람직한 형태이다. 스위스 압연 프로토콜의 중요한 부분은 압연 및 염색 postfixation의 스위스 롤 무결성 및 조직의 품질을 유지하기위한 조직의 유연성을 포함한다. 장 조직 FFPE 표준 스위스 롤 기법은 일반적 힘들고 시간 소모적 (2 일) (18, 19)이다. 또한,이 표준 방법은 일반적으로 R은 소장 조직을 수득elatively 뻣뻣하고 쉽게되지는 스위스 롤에 형성한다. 10 % 포르말린에서 장 해부 조직 밤새 인큐베이션 조직 압연 전의 요구되기 때문이다. .......

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Disclosures

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgements

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H&E 이미지를 제공해 주신 Ainara Ruiz de Sabando에게 감사드립니다. 이 연구는 Vincent W. Yang 박사에게 수여된 미국 국립보건원(DK052230, DK093680 및 CA172113)의 보조금으로 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
스테인레스 스틸 해부 키트VWR25640-002
은폐 제거 챔버Biocare MedicalDC2012
주사기 10 mlVWR89215-218
Swingsette 티슈 임베딩 / 처리 카세트 뚜껑포함 SimportM515
Superfrost Plus Slides [크기 : 25 x 75 x 1 mm]VWR48311-703
수동 슬라이드 염색 세트Tissue-Tek/Sakura4451
염색 접시 녹색Tissue-Tek/Sakura4456
염색 접시 흰색Tissue-Tek/Sakura4457
탈착식 손잡이가 있는 24-슬라이드 슬라이드 홀더Tissue-Tek/Sakura4465
오븐Thermo Scientific624365도 베이킹 슬라이드
해부 현미경ZeissStemi 2000C
형광 현미경NikonEclipse 90i밝고 형광등, 대물렌즈: 10X, 20X
PAP 펜 Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
에탄올 200 증명AAPR111000200
메탄올VWRBDH1135-4LP
빙초산AAPR281000ACS
크실렌피셔 사이언티픽X5P-1GAL
과산화수소 25% 물 용액아크로스202465000
10% 부퍼 포르말린Fisher Scientific22-026-213
소 혈청 분획 V, 열 충격Roche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
구연산나트륨Fisher ScientificS279
Gavage needleVWR20068-624
Rabbit anti Klf5 항체Santa Cruz Biotechnologysc-22797Dilution 1:150
Chicken anti EGFP 항체MilliporeAB16901Dilution 1:500
Rabbit anti Ki67 항체Biocare MedicalCRM325B희석 1:500
Mach3 토끼 AP 폴리머 검출 키트Biocare MedicalM3R533L
워프 레드 크로모겐 키트Biocare MedicalWR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 마우스 잭슨 연구소008875 
자동화 프로세서LeicaLeica TP1020

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. ....

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