Verbesserte Schweizer Walztechnik für Darmgewebepräparation zur immunhistochemischen und Immunofluoreszenz-Analysen
Summary
Die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Epithelzellen entlang der Darmschleimhaut sind wesentlich unterschiedlichen Zelllinien zu definieren. Die richtige Darstellung von Darmgewebe ist von entscheidender Bedeutung für die Identifizierung von Proteinexpressionsmuster mit maximaler Auflösung. Diese Studie hat zum Ziel, die optimalen Verfahren und Bedingungen für die Verarbeitung der Maus Darmgewebe zu beschreiben.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
Die Säuger Darmepithel umfasst eine einzelne Schicht aus säulen Zellen. Im Dünndarm werden die proliferative Zellen zu den Krypten beschränkt, während die differenzierten Zellen villus Region besetzen. Da es jedoch keine Zotten im Dickdarm sind, werden die proliferative Zellen auf den Boden der Krypten lokalisiert und differenzierten Zellen besetzen den oberen Bereich der Krypten. Darmepithel erfährt rasche Nachfüllung (ca. 3 – 5 Tage), die durch kontinuierliche Trennung der proliferativen Zellen in den Krypten angetrieben wird. Die proliferativen Zellen der Krypten sind keine homogene Bevölkerung und werden weiter in Stammzellen und Transit-Verstärkung (TA) Zellen 1 unterteilt. Die Stammzellen liegen an der Unterseite der Krypta, innerhalb der ersten 4 bis 5 Zellen von ganz unten 2. Das aktuelle Modell unterstützt die Existenz von zwei Arten von Stammzellen: Krypta Basis säulen (CBC) Stammzellen und Reserve ruhenden Stammzellen. Die CBC stem Zellen aktiv vermehren und werden von Leucin-rich repeat enthaltenden G-Protein – gekoppelten Rezeptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (OLFM4) 4 und Achaete scute-like 2 (Ascl2) 5 markiert. Auf der anderen Seite, sind Reserve ruhenden Stammzellen von B – Zell-spezifischen Moloney – Maus – Leukämie – Virus – Integrationsstelle 1 (Bmi1) 6, Maus Telomerase Reverse Transkriptase (mTERT) 7 gekennzeichnet, HOP Homeobox (Hopx) 8, Double-Like und CAM – Kinase -Wie 1 (DCLK1) 9, und leucinreichen Repeats und Immunoglobulin-ähnlichen Domänen 1 (Lrig1) 10. Die aktiv vermehrenden Stammzellen führen zu TA-Zellen dann eine weitere Differenzierung in absorptive Zellen durchlaufen (Enterozyten) und sekretorischen Zellen (enteroendokrinen, Becher, Paneth und Tuft-Zellen). Kontinuierliche Zellteilung in der proliferativen Zone führt zu einer Aufwärtsbewegung von Epithelzellen entlang der Krypta-villus Achse, bis sie oben auf der Zotten zu erreichen, wo sie unterziehen Apoptose und sindabgestoßen von der Oberfläche des Epithels ab. Die verschiedenen Arten von intestinalen Epithelzellen werden durch die Expression von bestimmten Proteinen markiert (zB intestinalen Becherzellen können durch Färbung mit Antikörper gegen MUC2 und Paneth – Zellen mit Antikörper gegen Lysozym zu erkennen). Wir untersuchen die Rolle der Krüppel-ähnlichen Faktoren (KLFs) in der Homöostase und Pathobiologie des Darmepithels 11-13. Die hier vorgestellten Ergebnisse , die Durchführbarkeit eines modifizierten Swiss-Walztechnik unterstützen , werden bei früheren Untersuchungen der Rolle von Krüppel-like factor 5 (KLF5) bei der Aufrechterhaltung der aktiv proliferierenden intestinalen epithelialen Stammzellen 14 basiert. KLF5 ist ein Faktor Zinkfinger – Transkriptions , die 12 in dem aktiven Darm Schaft und TA – Zellen stark exprimiert wird. Frühere Studien zeigten, dass KLF5 wird coexprimiert mit Ki-67, einem bekannten proliferative Marker in den Darmkrypten.
Die Magen-Darm-tr Akt ist kein strukturell oder funktionell homogenen Gewebe. Der Dünndarm wird in Duodenum unterteilt, Jejunum und Ileum und den Dickdarm in Caecum und Colon, wobei letztere weiter in proximaler unterteilt, mittleren und distalen Abschnitten. Jeder dieser Abschnitte hat einzigartige histologische Eigenschaften und spielt verschiedene Rollen 15. Als solche können die Auswirkungen von Beleidigungen und der Grad der Reaktion des Darmepithels kann 16 auf dem Bereich des untersuchten Gewebes abhängt. Darüber hinaus zeigen verschiedene Mausstämme Vielfalt der Antwort auf der histologischen Ebene basierend auf der Art der Insult in den Studien verwendet 16. Somit ist Gewebepräparation geziemt notwendig, geeignete histologische und molekulare Analyse der Darmgewebe zu ermöglichen. Als solche ermittelt die Swiss-Rolle-Technik gewährt Analyse der gesamten Länge des Darmepithel zu einer Zeit und damit gut informierte Schlussfolgerungen über umfassende Informationen.
e_content "> Die Swiss-Roll – Technik wurde zuerst von Magnus 17, erwähnt und im Detail von Moolenbeck und Ruitenberg und Park et al. , wie ein Verfahren zur Herstellung von Geweben und histologische Durchführung des Nagetiers Darm analysiert 18,19 dar. Das Protokoll in dieser Druckschrift abgegrenzt stellt eine verbesserte Version der ursprünglichen Methode, die für eine rechtzeitige und zuverlässige Gewebevorbereitung für diagnostische Zwecke ermöglicht. mit dieser modifizierte Technik für die effiziente Sammlung und Vorbereitung des Darmepithels für allgemein verwendete Techniken, wie der Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, als auch wie in situ – Hybridisierung (fluoreszierend und chromogenen 20). Ferner verwendet das modifizierte Gewebeprobe Herstellungsverfahren leicht verfügbar und relativ preiswerten Reagenzien während eines Verfahrens zur schnellen Gewebefixierung bietet und ermöglicht eine Rückgewinnung von Protein, DNA und RNA für zusätzliche Auswertung. Genommen zusammen, this-Technik eignet sich hervorragend für eine umfassende Beurteilung der histopathologischen, pathologische und molekulare Merkmale des Darmepithel.Protocol
Representative Results
Discussion
Die Schweizer Walztechnik ist eine leistungsfähige Methode zur Darmgewebe zur histologischen und morphologischen Beurteilung in großem Maßstab vor. Im Gegensatz zu dem zuvor beschriebenen Swiss-Walztechnik, die ursprünglich zur Herstellung von Gefrierschnitten 18,19 entwickelt wurde, stellte das Verfahren hier ermöglicht die schnelle intestinalen Gewebepräparation und Fixierung für Formalin Fixierung und Paraffineinbettung (FFPE). Im Vergleich zu gefrorenem Gewebe, hat FFPE Gewebe wesentlich längere H…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
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