Verbeterde Swiss-rolling Techniek voor darmweefsel Voorbereiding voor Immunohistochemische en Immunofluorescentie Analyses
Summary
Nauwkeurige identificatie en locatie van epitheelcellen langs de intestinale slijmvlies essentieel verschillende cellijnen definiëren. Een goede beeldvorming van darmweefsel is van cruciaal belang voor de identificatie van eiwit expressie patronen met maximale resolutie. Dit onderzoek heeft als doel om de optimale methoden en voorwaarden voor de verwerking van de muis intestinale weefsels af te bakenen.
Abstract
Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.
Introduction
Het zoogdier darmepitheel omvat een enkele laag van kolomvormige cellen. In de dunne darm worden de proliferatieve cellen beperkt tot de crypten terwijl gedifferentieerde cellen bezetten de villus regio. Omdat er geen villi in de dikke darm, de proliferatieve cellen gelokaliseerd in de bodem van de crypten en gedifferentieerde cellen bezetten het bovenste gebied van de crypten. Het darmepitheel ondergaat snelle aanvulling (ongeveer 3-5 dagen) die wordt aangedreven door continue verdeling van de proliferatieve cellen in de crypten. De proliferatieve cellen van de crypten geen homogene populatie en worden verder onderverdeeld in stamcellen en doorvoer amplificeren (TA) cellen 1. De stamcellen bevinden aan de onderkant van de crypte binnen de eerste 4-5 cellen van de bodem 2. Het huidige model ondersteunt het bestaan van twee typen stamcellen: crypt base zuilvormige (CBC) stamcellen en reserveer rustende stamcellen. De CBC sTEM-cellen zijn actief delende en worden gekenmerkt door leucine-rich-repeat bevattende G-eiwit gekoppelde receptor 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 en Achaete scute-achtige 2 (Ascl2) 5. Aan de andere kant, zijn reserve rustende stamcellen gelabeld door B-cel-specifieke Moloney muizen leukemie virus integratie plaats 1 (Bmi1) 6, muis telomerase reverse transcriptase (mTERT) 7, HOP Homeobox (Hopx) 8, doublecortin-achtige en CAM Kinase -achtige 1 (Dclk1) 9, en leucine-rijke herhalingen en immunoglobuline-achtige domeinen 1 (Lrig1) 10. Het actief prolifererende stamcellen aanleiding geven tot TA-cellen vervolgens ondergaan verdere differentiatie in absorberende cellen (enterocyten) en secretoire cellen (entero-endocriene, beker, Paneth en Tuft cellen). Continue celdeling in de proliferatieve zone leidt tot opwaartse beweging van epitheelcellen langs de crypte-villus as tot zij boven de villi, waar ze apoptose ondergaan en zijn bereiktafgeworpen van het oppervlak van het epitheel. De verschillende types van darmepitheelcellen worden gekenmerkt door de expressie van verschillende eiwitten (bijvoorbeeld, kan intestinale bekercellen door kleuren met antilichaam tegen MUC2 en Paneth cellen met antilichaam tegen lysozyme herkend). We bestuderen de rol van Krüppel-achtige factoren (KLFs) in de homeostase en pathobiologie van het darmepitheel 11-13. De hier voorgestelde ondersteuning van de haalbaarheid van een gemodificeerd Swiss-rolling techniek resultaten zijn gebaseerd op eerdere onderzoeken van de rol van Krüppel-achtige factor 5 (KLF5) in het onderhoud van het actief prolifererende intestinale epitheliale stamcellen 14. KLF5 een zinkvinger transcriptiefactor die hoog tot expressie in de actieve intestinale stamcellen en TA 12 cellen. Eerdere studies toonden aan dat KLF5 is co-expressie gebracht met Ki-67, een bekende proliferatieve marker in de intestinale crypten.
Het maag tr act is geen structureel of functioneel homogeen weefsel. De dunne darm bestaat uit duodenum, jejunum en ileum en de dikke darm in blindedarm en de dikke darm, waarbij de laatste verder verdeeld in proximale, midden en distale gedeelten. Elk van deze afdelingen heeft unieke histologische kenmerken en speelt verschillende rollen 15. Als zodanig kunnen de effecten van beledigingen en de mate van de respons van het darmepitheel afhankelijk regio onderzochte weefsel 16. Daarnaast worden verschillende muizenstammen tonen diversiteit van de respons op histologisch niveau op basis van het type insult in het onderzoek gebruikte 16. Aldus past weefselbereiding moeten passende histologische en moleculaire analyse van het darmweefsel mogelijk. Als zodanig, de Zwitsers-roll techniek subsidies analyse van de volledige lengte van het darmepitheel in één keer en zo constateert goed geïnformeerde conclusies op basis van uitgebreide informatie.
e_content "> de Swiss-roll techniek werd eerst vermeld door Magnus 17 en in detail beschreven door Moolenbeck en Ruitenberg en Park et al. een werkwijze voor het bereiden van weefsel en histologische analyses uitvoeren van het knaagdier darm 18,19 respectievelijk. Het protocol afgebakend in deze publicatie toont een verbeterde versie van de oorspronkelijke methode die het mogelijk maakt om actuele, betrouwbare weefselpreparatie voor diagnostische doeleinden. deze aangepaste techniek maakt efficiënte verzameling en voorbereiding van het darmepitheel van algemeen gebruikte technieken, zoals immunohistochemie, immunofluorescentie, alsmede zoals in situ hybridisatie (fluorescerende en chromogene 20). Bovendien is de gemodificeerde weefselspecimen bereidingswijze gebruikt gemakkelijk beschikbaar en relatief goedkope reagentia terwijl het een werkwijze voor snelle fixatie van het weefsel en maakt terugwinning van eiwitten, DNA en RNA voor extra evaluatie. Genomen samen, this techniek is uitstekend voor uitgebreide beoordeling van histopathologische, pathologische en moleculaire kenmerken van het darmepitheel.Protocol
Representative Results
Discussion
De Zwitserse rollen techniek is een krachtige methode voor het bereiden darmweefsel voor histologische en morfologische beoordeling op grote schaal. In tegenstelling tot de eerder beschreven Swiss walsen techniek die oorspronkelijk is ontwikkeld voor bereiding van ingevroren secties 18,19, de hier gepresenteerde maakt snelle voorbereiding darmweefsel en fixatie voor formaline fixatie en inbedden in paraffine (FFPE). In vergelijking met ingevroren weefsel, FFPE weefsel heeft veel langere houdbaarheid en is het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Ainara Ruiz de Sabando for providing H&E images. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (DK052230, DK093680 and CA172113) awarded to Dr. Vincent W. Yang.
Materials
| Stainless Steel Dissecting Kits | VWR | 25640-002 | |
| Decloaking Chamber | Biocare Medical | DC2012 | |
| Syringe 10ml | VWR | 89215-218 | |
| Swingsette Tissue embedding/processing cassette with lid | Simport | M515 | |
| Superfrost Plus Slides [size: 25x75x1mm] | VWR | 48311-703 | |
| Manual Slide Staining Set | Tissue-Tek/Sakura | 4451 | |
| Staining Dish Green | Tissue-Tek/Sakura | 4456 | |
| Staining Dish White | Tissue-Tek/Sakura | 4457 | |
| 24-Slide Slide Holder with Detachable Handle | Tissue-Tek/Sakura | 4465 | |
| Oven | Thermo Scientific | 6243 | for baking slides at 65 degree |
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000C | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse 90i | Bright and fluoerescent light, with objectives: 10x, 20x |
| PAP Pen Super-Liquid Blocker Mini | Fisher Scientific | DAI-PAP-S-M | |
| Ethanol 200 proof | AAPR | 111000200 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Glacial acetic acid | AAPR | 281000ACS | |
| Xylene | Fisher Scientific | X5P-1GAL | |
| Hydrogen peroxide 25% solution in water | ACROS | 202465000 | |
| 10% bufered formalin | Fisher Scientific | 22-026-213 | |
| Bovine serum fraction V, heat shock | Roche | 3116956001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P7949 | |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | S279 | |
| Gavage needle | VWR | 20068-624 | |
| Rabbit anti Klf5 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-22797 | Dilution 1: 150 |
| Chicken anti EGFP antibody | Millipore | AB16901 | Dilution 1: 500 |
| Rabbit anti Ki67 antibody | Biocare Medical | CRM325B | Dilution 1: 500 |
| Mach3 rabbit AP polymer detection kit | Biocare Medical | M3R533L | |
| Warp red chromogen kit | Biocare Medical | WR806 H | |
| Lgr5-EGFP/CreERT2 mice | Jackson labs | 008875 | |
| Automated processor | Leica | Leica TP1020 |
References
- van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
- Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
- Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
- Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
- May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
- Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
- Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
- McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
- McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
- Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
- Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
- De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
- Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
- Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The “Swiss roll”: a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
- Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical ‘swiss roll’ method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, 115-120 (1987).
- Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
- Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
- el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
- McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
- Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
- Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, (2008).
