הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae
Summary
This protocol provides step-by-step instruction on how to generate parabiotic zebrafish embryos of different genetic backgrounds. When combined with the unparalleled imaging capabilities of the zebrafish embryo, this method provides a uniquely powerful means to investigate cell-autonomous versus non-cell-autonomous functions for candidate genes of interest.
Abstract
parabiosis כירורגי של שתי חיות של רקע גנטי שונה יוצר תרחיש ייחודי ללמוד תא פנימי לעומת תפקידי תא-חיצוני עבור גני מועמדים של עניין, התנהגויות נדידה של תאים, אותות מופרשים הגדרות גנטיות מובהקות. בגלל חי parabiotic לשתף תפוצה משותפת, כל דם או גורם מובל דם חיה אחת יתחלף עם השותף שלה, ולהיפך. לכן, תאים וגורמים מולקולריים מרקע גנטי אחד ניתנים ללמוד בהקשר של רקע גנטי שני. Parabiosis של עכברים בוגרים כבר נעשה שימוש נרחב להזדקנות מחקר, סרטן, סוכרת, השמנת יתר, והתפתחות המוח. לאחרונה, parabiosis של עוברי דג הזברה נעשה שימוש כדי ללמוד את הביולוגיה ההתפתחותית של hematopoiesis. בניגוד לעכברים, האופי השקוף של עוברי דג זברה מתיר הדמיה הישירה של תאים בהקשר parabiotic, מה שהופך אותו שיטה חזקה באופן ייחודי על חקירת fמנגנונים תאיים ומולקולריים undamental. השירות של טכניקה זו, לעומת זאת, הוא מוגבל על ידי עקומת למידה תלולה להפקת עוברי דג הזברה parabiotic. פרוטוקול זה מספק שיטת צעד אחר צעד כיצד בניתוח פתיל blastulae של שני עוברי דג זברה של רקע גנטי שונה לחקור את התפקיד של גני מועמדים מעניינים. בנוסף, עוברי דג הזברה parabiotic סובלניים הלם חום, מה שהופך שליטה הזמני של ביטוי גנים אפשריים. שיטה זו אינה דורשת הגדרה משוכללת בעל יישומים רחבים ללימוד נדידת תאים, מפרט גורל, והבחנת in vivo במהלך התפתחות עוברית.
Introduction
יצירת פסיפסים גנטיים (מפלצות) בין wild-type ובעלי החיים מהונדסים גנטיים היא אסטרטגיה ומבוססת וקלסי לחקירת תא-מהותי לעומת פונקציות תא-חיצוני של גני המועמדים 1-6. Blastula השתלת דג הזברה נוצלה נרחב כדי לייצר עובר chimeric ללימודים של תא-אוטונומיה 7-9. בהתאם הרקמה של עניין, לעומת זאת, זה יכול להיות מאתגר למקד תאים תורמים כצפוי לרקמה הרצויה (למשל, דם) 1-3, 7-9. גנטיקאים עכבר זמן מנוצלים שיטות כירורגיות parabiotic ליצור אורגניזמים סיאמיים עם תפוצה משותפת 10-14. בגלל חי parabiotic לשתף דם משותף, אינטראקציות בין תאים שמקורם מן חי אחד עם תאים של בעלי החיים האחרים של רקע גנטי שונה ניתן ללמוד 10-16. לאחרונה, הקבוצה של כרימה Kissa באלגנטיות הפגינו את היכולת creאכלו עוברי דג הזברה סיאמיים ולאחר מכן להשתמש במערכת הזאת כדי ללמוד גזע hematopoietic ו תא אב (HSPC) ההגירה 15. בנוסף, parabiosis דג הזברה שימש לאחרונה לחקור את התפקיד של cadherin אנדותל 5 בתא גזע hematopoietic (HSC) הופעתה והגירה, 16 ו כדי ללמוד את התפקיד של תאי סטרומה בגומחה HSPC במהלך ההתפתחות דג הזברה 17.
בניגוד עכברים, עוברי דג הזברה הם שקוף ולאפשר להדמיה ישירה של תאים במהלך ההתפתחות parabiotic, מה שהופך את מערכת רבת עוצמה באופן ייחודי. השירות של parabiosis דג זברה, לעומת זאת, הוא מוגבל על ידי עקום למידה תלולה, וניתוחי parabiotic על העוברים העדינים יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ללא הדרכה מפורטת והדגמה ויזואלית. מטרת פרוטוקול זה היא לספק סט של ברור, צעד-אחר-צעד ללוות הדרכות וידאו מבוסס על איך ליצור עוברי דג הזברה parabiotic ללימודזמני, תא-מהותי, או פונקציות חיצוני תאים של גן מועמד (ים) על ידי היתוך כירורגית לפתח blastulae. שינויים עיקריים והמלצות נוספות להישרדות parabiont הגדלה ויישומים ניסיוניים חדשים כלולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
היתוך Parabiotic כבר כלי רב עוצמה כדי לחקור תפקודים תאיים של גנים מועמדים בדגמים עוברים חומוס בעכברים בוגרים 10-14. לאחרונה, שיטה היתוך blastula תוארה להפקת 15 עוברי דג הזברה סיאמיים. בפרוטוקול הנוכחי, הדרכות וידאו מבוססות משמשות כדי להדגים וטוב יותר לתאר את המתודולו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Julie R. Perlin for helpful comments on the manuscript. D.I.S. is supported by grants from the American Society of Hematology, the Cooley’s Anemia Foundation, and the NIH (K01DK085217 and R03DK100672). E.J.H. is a Howard Hughes Medical Institute Fellow of the Helen Hay Whitney Foundation. B.L. is a Howard Hughes Medical Institute Medical Research Fellow. B.W.B. is supported by an Irvington Fellowship from the Cancer Research Institute and a Young Investigator Award from the Conquer Cancer Foundation of ASCO. L.I.Z. is supported by grants from the NIH (R01CA103846, P01HL032262, and R01HL04880), Taub Foundation for MDS Research, Harvard Stem Cell Institute, and is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
Materials
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 |
| Individual components for E3/HCR: | For 1L: 14,61g NaCl, 0,63g KCl, 2,43g CaCl2-2H2O, 1,99g MgSO4 | |
| NaCl (Sodium chloride) | Sigma-Aldrich | S9888 |
| KCl (Potassium chloride) | Sigma-Aldrich | P9541 |
| CaCl2 (Calcium chloride dihydrate) | Sigma-Aldrich | 223506 |
| MgSO4 (Magnessium sulfate heptahydrate) | Sigma-Aldrich | 230391 |
| Hepes (1M ) buffer solution | ThermoFisher | 15630-080 |
| Name | Company | Catalog Number |
| Antibiotics: | ||
| Pen/Strep | gibco by Life technologies | 15140-120 |
| Ampicilin sodium salt | Sigma Life Science | A0166 |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma Life Science | K1377 |
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number |
| 50 mg/ml Pronase from Streptomyces griseus | Roche | 11459643001 |
| capillary glass used for needles (Capillary Glass & Filaments) | Sutter Instrument | ITEM#: BF 100-50-10 |
| Teasing needles with wooden handles | Fisher Scientific | S07894 |
| Glass Pasteur pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A |
| 10 mL pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor) | Novatech International | F37898-0000 |
| 100 mm diameter/ 20 mm deep plastic petri dishes (PETRI DISH, 100/20 MM, PS, CLEAR, WITH VENTS, HEAVY DESIGN, 15 PCS./BAG ) |
Greiner Bio-one | 664102 |
| Dextran, Cascade Blue, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable | ThermoFisher | D-1976 |
| PTU. working stock is 0.003% (50X is 0.15%). for 500ml, 0.75 g N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 |
| Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S) | Western Chemical Inc | MS 222 |
| LMP agarose (Ultrapure LMP agarose) | Invitrogen | 16520100 |
| plastic transfer pipette (just the wide ended one I think) | Fisherbrand | 137115AM |
| Glass-bottom 6-well plates used for imaging | MatTek | P06G1.5-20-F |
| plastic western gel loading tip fixed on the end of a wood-handled dissecting needle (GELoader tips) | Eppendorf | 22351656 |
| glass cover slips, slides and vacuum grease if mounting for an upright microscope: | ||
| Vaccum grease ( Dow Corning® high-vacuum silicone grease colorless, weight 5.3 oz (tube) ) |
Dow Corning | Z273554 |
| Glass cover slips | Corning Life Sciences | 2960-244 |
References
- Zon, L. I., Orkin, S. H. Hematopoiesis: An evolving paradigm for stem cell biology. Cell. 132 (4), 631-644 (2008).
- Dzierzak, E., Speck, N. A. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nat Immunol. 9 (2), 129-136 (2008).
- Li, P., et al. Epoxyeicosatrienoic acids enhance embryonic haematopoiesis and adult marrow engraftment. Nature. 523 (7561), 468-471 (2015).
- Tam, P. P., Rossant, J. Mouse embryonic chimeras: tools for studying mammalian development. Development. 130 (25), 6155-6163 (2003).
- Tanaka, M., Gertsenstein, M., Rossant, J., Nagy, A. Mash2 acts cell autonomously in mouse spongiotrophoblast development. Dev. Biol. 190 (1), 55-65 (1997).
- Morin-Kensicki, E. M., Faust, C., LaMantia, C., Magnuson, T. Cell and tissue requirements for the gene eed during mouse gastrulation and organogenesis. Genesis. 31 (4), 142-146 (2001).
- Ho, R. K., Kane, D. A. Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors. Nature. 348 (6303), 728-730 (1999).
- Parker, L., Stainier, D. Y. Cell-autonomous and non-autonomous requirements for the zebrafish gene cloche in hematopoiesis. Development. 126 (12), 2643-2651 (1999).
- Liao, E. C., Trede, N. S., Ransom, D., Zapata, A., Kieran, M., Zon, L. I. Non-cell autonomous requirement for the bloodless gene in primitive hematopoiesis of zebrafish. Development. 3 (3), 649-659 (2002).
- Kamran, P., Sereti, K. I., Zhao, P., Ali, S. R., Weissman, I. L., Ardehali, R. Parabiosis in mice: a detailed protocol. J Vis Exp. (80), (2013).
- Wagers, A. J., Sherwood, R. I., Christensen, J. L., Weissman, I. L. Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science. 297 (5590), 2256-2259 (2002).
- Hervey, G. R. The effects of lesions in the hypothalamus in parabiotic rats. J. Physiol. 145 (2), 336-352 (1959).
- Goldman, D. C., Bailey, A. S., Pfaffle, D. L., Al Masri, A., Christian, J. L., Fleming, W. H. BMP4 regulates the hematopoietic stem cell niche. Blood. 114 (20), 4393-4401 (2009).
- Dieterlen-Lièvre, F., Martin, C., Beaupain, D. Quail-chick chimaeras and parabionts: several new models to investigate early developmental events in the haemopoietic system. Folia Biol (Praha). 25 (5), 293-295 (1979).
- Demy, D. L., Ranta, Z., Giorgi, J. M., Gonzalez, M., Herbomel, P., Kissa, K. Generating parabiotic zebrafish embryos for cell migration and homing studies). Nat. Methods. 10 (3), 256-258 (2013).
- Anderson, H., et al. Hematopoietic stem cells develop the absence of endothelial cadherin 5 expression. Blood. 126 (26), 2811-2820 (2015).
- Murayama, E., Sarris, M., Redd, M., Le Guyader, D., Vivier, C., Horsley, W., Trede, N., Herbomel, P. NACA deficiency reveals the crucial role of somite-derived stromal cells in haematopoietic niche formation. Nat Commun. 28 (6), 8375 (2015).
- Shah, D. I., et al. Mitochondrial Atpif1 regulates haem synthesis in developing erythroblasts. Nature. 491 (7425), 608-612 (2012).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160 (1-2), 241-252 (2015).
- Adám, A., Bártfai, R., Lele, Z., Krone, P. H., Orbán, L. Heat-inducible expression of a reporter gene detected by transient assay in zebrafish. Exp. Cell Res. 256 (1), 282-290 (2000).
