Ein zellfreien Assay unter Verwendung von<em> Xenopus laevis</em> Embryo Extrahiert Mechanismen der Kerngröße Verordnung zum Studium

Summary

Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.

Abstract

Eine grundlegende Frage in der Zellbiologie ist wie Zell- und Organell Größen reguliert werden. Es ist seit langem erkannt worden, dass die Größe des Kerns im allgemeinen mit der Größe der Zelle skaliert, insbesondere während der Embryonalentwicklung, wenn dramatische Verringerungen sowohl in Zell- und Kerngrößen auftreten. Mechanismen der Regulation der Kerngröße sind weitgehend unbekannt und kann zu Krebs relevant sein , wenn veränderte Kerngröße ein wichtiger diagnostischer und prognostischer Parameter ist. In – vivo – Ansätze zur Kerngröße Regula Identifizierung mit den grundlegenden und komplexen Natur der Kernfunktion kompliziert sind. Die in vitro – Ansatz hier beschriebenen Kerngrößensteuerung zu studieren nutzt die normale Verringerungen der Kerngröße , die während der Xenopus laevis Entwicklung auftreten. Zuerst werden Kerne in X. zusammengebaut laevis Ei – Extrakt. Dann werden diese Kerne isoliert und in Zytoplasma von späten Stadium Embryonen erneut suspendiert. Nach einer 30-90 min Inkubationszeit, Kernflächeverringert sich um 20 bis 60%, einen nützlichen Test bietet Cytoplasma-Komponenten, die in späten Stadium Embryonen zu identifizieren, die zu Entwicklungskerngrößenskalierung beitragen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Vorgehensweise ist die relative Leichtigkeit, mit der das Ei und Embryoextrakte können biochemisch manipuliert werden, so dass für die Identifizierung neuer Proteine ​​und Aktivitäten, die Kerngröße zu regulieren. Wie bei jedem in vitro – Ansatz, der Validierung der Ergebnisse in einem in vivo – System ist wichtig, und die Mikroinjektion von X. laevis Embryonen ist für diese Untersuchungen besonders geeignet.

Introduction

Die Größen der Zellorganellen maßstabs typischerweise mit der Größe der Zelle, und das mit der Zellgröße ^1-10 für die Skalierung der Kerngröße ist vielleicht am besten dokumentiert. Dies gilt insbesondere während der Embryogenese und der Zelldifferenzierung, wenn dramatische Verringerungen sowohl in Zell- und Kerngröße häufig ^11,12 beobachtet. Ferner verändert Kerngröße ist ein wichtiger Parameter bei der Krebsdiagnose und -prognose ^13-17. Die Mechanismen, die zur Kerngrößenregulierung beitragen, sind weitgehend unbekannt, aufgrund der Komplexität und Wesen der Kernstruktur und Funktion teilweise. Das Verfahren hier wurde als ein in vitro – Assay für die Kerngröße Skalierung beschrieben entwickelt, die biochemische Manipulation und Aufklärung von Mechanismen der Kerngrößenregulierung zugänglich ist.

Xenopus laevis Ei – Extrakt ist ein gut etabliertes System komplexe zelluläre Prozesse in einem in – vitro zu rekapitulieren und studieren </em> Kontext. Diese Extrakte haben ergeben , neue grundlegende Informationen über verschiedene zelluläre Prozesse einschließlich der Montage und Funktion der mitotischen Spindel, endoplasmatischen Reticulum und Kern ^18-22. Ein wesentlicher Vorteil des Systems ist , dass Extrakt X. Eiextrakten laevis stellen eine nahezu unverdünnten Zytoplasma deren Zusammensetzung kann leicht verändert werden, beispielsweise durch Zugabe von rekombinanten Proteinen oder Immunodepletion. Weiterhin ist eine wesentliche Prozesse manipulieren können durch Behandlungen , die die ansonsten letalen in einem in vivo – Kontext sein könnten. Änderungen des Eies Extrakt Verfahren ermöglichen eine Trennung von Auszügen aus X. laevis Embryonen statt Eier, und diese Embryo – Extrakte sind gleichermaßen zugänglich biochemische Manipulation ^23. Während X. laevis – Entwicklung, die Einzelzell befruchteten Embryo (~ 1 mm Durchmesser) durchläuft eine Reihe von zwölf schnellen Zellteilungen (Stufen 1 bis 8) bis zu mehreren Tausend erzeugen 50 μm Durchmesser und kleinere Zellen, eine Entwicklungsstufe erreicht nannte die midblastula Übergang (MBT) oder Stufe ^{24 bis 26 August.} Der MBT wird durch den Beginn der zygotischen Transkription, Zellmigration, asynchrone Zellteilungen, den Erwerb von Spaltphasen und Errichtung von Kern Steady-State-Größen statt kontinuierliche Ausbau der Kernkraft wie in der Pre-MBT Embryo aus. Von Stufe 4 bis Gastrulation (Stufen 10,5-12), verringert sich das Volumen der einzelnen Kerne um mehr als 10-fach ^11.

Hier ist das Ziel, die Mechanismen zu identifizieren, die für diese Verringerung der Kerngröße während der Entwicklungsfortschritt. Der Ansatz besteht darin, zunächst Kerne montieren in X. laevis Ei – Extrakt und um diese Kerne aus dem Ei Zytoplasma / Extrakt isolieren. Diese Kerne werden dann in Zytoplasma von Ende Gastrulastadium Embryonen erneut suspendiert. Nach einer Inkubationszeit, werden die Kerne aus Ei-Extrakt kleiner Extrakt späten Stadium Embryo. Wir schlussfolgerten, dass diese would ein nützlicher Test sein für die Identifizierung zytoplasmatische Komponenten in späten Stadium Embryonen, die zur Entwicklung der Kerngrößenskalierung beitragen. Unter Verwendung dieses Tests in Verbindung mit in vivo – Validierung, haben wir gezeigt , dass die Proteinkinase C (PKC) trägt zur Entwicklungs Verringerungen der Kerngröße in X. laevis ^23.

Protocol

Alle Xenopus Verfahren und Untersuchungen wurden in Übereinstimmung mit den NRC – Führer für die Pflege und Verwendung von Labortieren 8. Auflage durchgeführt. Protokolle wurden von der University of Wyoming Institutional Animal Care und Use Committee (Assurance # A-3216-01) zugelassen. 1. Herstellung von X. laevis Ei – Extrakt (angepasst von 27,28) Prime weiblichen X. laevis Frösche ein Minimum von drei Tagen und höchstens zwei Wochen vor der Eiersammlung mit…

Representative Results

Versammlung der Nuclei in Egg Extract Die ersten Schritte dieses Protokolls sind X vorzubereiten laevis Ei – Extrakt (Protokoll 1) und demembranated Samenkerne (Protokoll 2). Diese Reagenzien werden dann verwendet , um Kerne montieren de novo (Protokoll 3). Abbildung 1 zeigt einige repräsentative Daten. Die Zugabe von Kalzium treibt die meiotisch verhaftet Ei-Extrak…

Discussion

Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…

Materials

Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG	Molecular Probes	A10037
ATP disodium salt	Sigma Aldrich	A2383
Benzocaine	Sigma Aldrich	E1501
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A3059
CaCl2	Sigma Aldrich	C3306
Centrifuge	Beckman	J2-21M
Centrifuge rotor	Beckman	JS 13.1
chymostatin	Sigma Aldrich	C7268
creatine phosphate disodium	Calbiochem	2380
cycloheximide	Sigma Aldrich	C6255
cytochalasin D	Sigma Aldrich	C8273
disposable wipes (kimwipes)	Sigma Aldrich	Z188956
L-cysteine	Sigma Aldrich	W326306
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Formaldehyde	Sigma Aldrich	F8775
Glass crystallizing dish (150×75 mm)	VWR	89090-662
Glycerol	Macron	5094-16
HEPES	Sigma Aldrich	H4034
Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride	Sigma Aldrich	B2261
HCG – Human Chorionic Gonadotropin	Prospec	hor-250-c
L15 Media	Sigma Aldrich	L4386
leupeptin	Sigma Aldrich	L2884
Lysolecithin	Sigma Aldrich	L1381
mAb414	Abcam	ab24609
MgCl2	EMD	MX0045-2
MgSO4	Sigma Aldrich	M9397
Maltose	Sigma Aldrich	M5885
NP40	BDH	56009
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin + Streptomycin	Sigma Aldrich	Pp0781
pepstatin	Sigma Aldrich	P5318
PIPES	Sigma Aldrich	P6757
Plastic paraffin film (parafilm)	Sigma Aldrich	P7793
KCl	Sigma Aldrich	P9541
KH2PO4	Mallinckrodt	70100
KOH	Baker	5 3140
PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Prospec	hor-272-a
NaCl	Sigma Aldrich	S3014
NaHCO3	Fisher	BP328
NaHPO4	EMD	SX0720-1
NaOH	EMD	SX0590
Pestle	Thomas Scientific	3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml	Corex	8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG)	ThermoFisher	A10037
sucrose	Calbiochem	8550
thermal cycler	Bio-Rad	T100
Ultracentrifuge	Beckman	L8-80M
Ultracentrifuge rotor	Beckman	SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium)	Vector	H-1000