Lentivirus óptimo de producción y el cultivo celular condiciones necesarias para la transducción de éxito células epiteliales bronquiales humanos primarios
Summary
Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.
Abstract
El cultivo in vitro de células humanas primarias del epitelio bronquial (HBE) usando condiciones de interfaz aire-líquido proporciona un modelo útil para estudiar los procesos de diferenciación celular de las vías respiratorias y la función. En los últimos años, el uso de vectores lentivirales para la entrega transgén se convirtió en una práctica común. Mientras que hay informes de la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias completamente diferenciadas con ciertas lentivirus seudo-tecleado sin infección por VIH, la eficiencia global de transducción es generalmente menos de 15%. El protocolo presentado aquí proporciona un método fiable y eficiente para producir lentivirus y para la transducción de células epiteliales bronquiales humanas primarias. El uso de células epiteliales bronquiales no diferenciadas, la transducción en medio de crecimiento epitelial bronquial, mientras que las células se adhieren, con una multiplicidad de infección de factor de 4 proporciona eficiencias de cerca de 100%. Este protocolo describe, paso a paso, la preparación y la concentración de los vectores de lentivirus de alto título y THproceso de transducción e. Se analizan los experimentos que determinaron las condiciones óptimas de cultivo para lograr la transducción de alta eficiencia de las células epiteliales bronquiales humanas primarias.
Introduction
El desarrollo de los lentivirus, pseudotyped replicación defectuosa (LV) ha proporcionado a los investigadores un método seguro y eficaz para entregar los transgenes in vitro 1. Debido a su expresión a largo plazo, estos LV también podría ser utilizado para la administración de agentes terapéuticos in vivo 2,3. La producción de LV requiere co-transfección de riñón embrionario humano (HEK) células con varios plásmidos: vector de transferencia, de la mordaza de embalaje / pol, rev embalaje, y el sobre vesicular glicoproteína del virus de la estomatitis (VSV-G) plásmidos. Sistemas de envasado de tercera generación se consideran más seguros que los sistemas de segunda generación porque el gen rev se codifica en un plásmido de empaquetamiento separado, reduciendo así la posibilidad de recombinación para producir un lentivirus de replicación competente. Aunque los sistemas de envasado de segunda generación producen cinco unidades de transducción totales más altos de plegado, la escisión del genoma viral original para crearel sistema de tercera generación se ha reducido el nivel de transducción sólo mínimamente 3,4.
Mientras que las líneas de células pueden ser transducidas con mayor facilidad y de manera eficiente, los investigadores han cambiado su enfoque a las células primarias, ya que estos son más representativos de tejidos in vivo 5,6. Sin embargo, las células primarias son refractarios a la transducción. Si bien se ha informado de la transducción de las células epiteliales de las vías respiratorias totalmente diferenciadas, la eficiencia global no ha superado el 15% 7.
Aquí se describe un protocolo que permite la producción de volúmenes lógicos de alto título. Un enfoque paso a paso se describe para alcanzar casi el 100% la eficacia de transducción en células primarias HBe. Más específicamente, el protocolo describe las condiciones de cultivo óptimas instrumentales para tener éxito 3. Brevemente, las células HEK 293T se transfectan con el vector de expresión lentiviral Pcdh con el objetivo EF-1 promotor que dirige la expresión de verde fluorescenteproteína (eGFP) o mCherry, una proteína fluorescente de color rojo, y un sistema de envasado de tercera generación. LV liberadas en los medios de comunicación se recogen de 24 a 72 horas más tarde. Las partículas de virus se concentran con polietilenglicol (PEG), un método conveniente y fácil de la concentración viral, antes de la estimación de título usando un kit de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima antígeno p24 (ELISA). Posteriormente, las células primarias HBe indiferenciadas son transducidas en medios de proliferación (medio de crecimiento epitelial bronquial o BEGM) 8, mientras que la fijación (después de ser tripsinizadas), a una multiplicidad de infección (MOI) factor de 4, la adición de bromuro de hexadimetrina e incubando durante 16 hr ( durante la noche). Las células se dejan a diferenciarse. Puesto que el transgén viral se expresa a largo plazo (mediante el promotor apropiado, véase la discusión), la expresión se mantendrá durante la diferenciación en un epitelio de las vías respiratorias pseudostratified o puede ser inducida (usando un promotor inducible) después de la diferenciación.
<p clculo = "jove_content"> Este protocolo es de gran interés para los investigadores que desean utilizar células primarias HBe en lugar de líneas celulares, y podría ser adaptable a otros difíciles para la transducción de tipos de células.Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí asegura cerca de 100% de eficiencia de transducción. Sin embargo, hay algunos pasos durante el proceso que son importantes para lograr este objetivo. Por ejemplo, durante el proceso de transfección, la presencia de precipitados en la mezcla de transducción (caída) o en el plato de la días después de la transducción (Figuras 1b y d) son relevantes para una buena transfección. La ausencia de un precipitado o la presencia de aglomerados puede ser debido …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a la Alianza Agencia de Recuperación de Órganos Vida de la Universidad de Miami para proporcionar pulmones. También agradecemos al Dr. Lisa Künzi para la preparación de ADN utilizado para los experimentos se muestra en la Figura 2B y 3-D, el Dr. Ben Gerovac y Lisa Novak para el virus mCherry utilizado para los experimentos en las Figuras 3A a C. También se agradece a Gabriel Gaidosh desde la instalación de imágenes, Departamento de Oftalmología de la Universidad de Miami.
Este estudio ha sido patrocinado por subvenciones del NIH, la Fundación de FQ y la asistente de vuelo Instituto de Investigación Médica Dr. Matthias Salathe.
Materials
| HEK293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | 12306C | use at 10% |
| DMEM | Thermo Scientific | 11995-040 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Thermo Scientific | 15140-122 | use at 1x |
| Collagen I | BD Biosciences | 354231 | dilute 1:75 in distilled water |
| Calphos | Clontech | 631312 | Transfection kit containing 2M Calcium solution, 2X HEPES-Buffered solution (HBS) and sterile H2O |
| Polythylene glycol 8000 | VWR scientific | 101108-210 | stock of 40% |
| Amphotericin B | Sigma | A9528 | use at 1x |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Transwell 12mm | Corning | 3460 | |
| Collagen IV | Sigma | C7521 | dilute 1:10 in distilled water |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | stock of 2mg/ml |
| Puromycin (10.000x) | Thermo Scientific | A11138-03 | use at 1x |
| Alliance HIV-1 p24 ELISA | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| F12 | Thermo Scientific | 11765-054 | |
| pCDH-EF1-MCS-IRES-Puro | System Biosciences | CD532A-2 | lentiviral expression vector |
| pMD2-VSVG | Addgene | 12259 | packaging DNA |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | packaging DNA |
| pRSV-rev | Addgene | 12253 | packaging DNA |
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