अस्थि मज्जा पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का रेट्रोवायरल transduction टी सेल रिसेप्टर Retrogenic चूहे उत्पन्न करने के लिए
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
टी सेल रिसेप्टर (TCR) मनुष्यों और चूहों के प्रदर्शनों की सूची 1 एक्स 10 8 और 2 एक्स 10 6 अद्वितीय TCRs क्रमश: 1,2 में अनुमान लगाया गया है। यह बड़ी विविधता टी कोशिकाओं आत्म पेप्टाइड्स के साथ ही प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (एमएचसी) प्रतिजन कोशिकाओं (APCs) पर द्वारा प्रस्तुत रोगजनकों से निकाली गई प्रतिजन epitopes का एक विशाल सरणी पहचान करने के लिए अनुमति देता है। अद्वितीय पेप्टाइड एमएचसी परिसरों के साथ TCRs की बातचीत में सूक्ष्म अंतर हुक्म है कि क्या एक टी सेल apoptosis, निष्क्रियता, सक्रियण, भेदभाव, साइटोकाइन उत्पादन या cytotoxicity से गुजरना होगा। हालांकि, बड़े TCR प्रदर्शनों की सूची की वजह से, कैसे एक विशिष्ट TCR एक विशेष प्रतिजन का जवाब देंगे के विश्लेषण के एकल TCR सिस्टम के उपयोग की आवश्यकता है।
विभिन्न TCR ट्रांसजेनिक चूहों एक विवो मॉडल 3-9 में एक भी TCR के समारोह का अध्ययन करने के क्रम में उत्पन्न किया गया है। हालांकि, वहाँ सहित ट्रांसजेनिक चूहों TCR करने के लिए निरंतर कर रहे हैंलागत, समय एक भी ट्रांसजेनिक माउस और germline डीएनए 10 में यादृच्छिक ट्रांस्जीन प्रविष्टि के तथाकथित संस्थापक प्रभाव उत्पन्न करने के लिए की लंबाई। इसलिए, अपेक्षाकृत कुछ TCR ट्रांसजेनिक चूहों किसी भी प्रतिजन के लिए उत्पन्न किया गया है और एक ही मिलान के लिए उच्च और निम्न TCR समानता के कार्यात्मक निहितार्थ शायद ही कभी संबोधित कर रहे हैं। और स्क्रीन करने के लिए एक तेजी से दृष्टिकोण की आवश्यकता का पता व्यक्तिगत रूप से या संयोजन में कई TCRs का अध्ययन करने के लिए, retrogenic ( 'रेट्रो' रेट्रोवायरस से और ट्रांसजेनिक से 'Genic') चूहों ट्रांसजेनिक चूहों 11-13 TCR के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग किया गया है।
2A पेप्टाइड आम सहमति के मूल भाव के कई वायरस के भीतर पाया, एक 2A-एएसपी-वैल / इले-भरमार एक्स-Asn-प्रो-Gly -2 बी-प्रो से मिलकर बनता है, जिसमें दरार 2A की ग्लाइसिन और 2 बी के प्रोलाइन के बीच होता है सीआईएस -acting hydrolase गतिविधि से, अनुवाद 10,14-16 दौरान ribosomal लंघन हो जाती है। एक विस्तृत चित्र ग चित्रण के लिएविभिन्न 2A पेप्टाइड (F2A, E2A, T2A और P2A) की leavage संदर्भों 10 के लिए कृपया देखें – इस तरीके में 12, 2 cistrons (TCR अल्फा और बीटा TCR) एक एकल वेक्टर में stoichiometric अनुवाद में जिसके परिणामस्वरूप जोड़ा जा सकता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग, हम व्यक्त करने के लिए और सीधे विवो में कई विशिष्ट प्रतिजन TCRs की तुलना में सक्षम हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में, इष्टतम अस्थि मज्जा स्वास्थ्य, पारगमन दक्षता और पुनर्गठन सुनिश्चित करने के लिए विस्तार के लिए कई महत्वपूर्ण कदम हम। पहला महत्वपूर्ण कदम पीढ़ी और जीपी + E86 वायरल उत्पादक कोशिकाओं के समुचि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच (5K22A1119151-01 और 1R56DK104903-01) एमएलबी, बीसीएम में मधुमेह अनुसंधान केंद्र (P30-DK079638) के पायलट / व्यवहार्यता कार्यक्रम, JDRF 1-एफ ए सी-2014-243-AN APF, एडीए करने से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया 1-15-JF-07, इम्यूनोलॉजी फैलोशिप एमबी करने के लिए, और रॉबर्ट और जेनिस McNair फाउंडेशन में एएआई करियर।
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
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