Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
T – Zell – Rezeptor (TCR) Repertoire von Mensch und Maus wurde mit 1 x 10 8 und 2 x 10 6 einzigartige TCRs jeweils 1,2 geschätzt. Diese große Vielfalt ermöglicht T-Zellen eine Vielzahl von Antigen-Epitope aus selbst Peptiden sowie von Pathogenen dargestellt durch den Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) abgeleitet zu erkennen. Die feinen Unterschiede in den Wechselwirkungen der TCRs mit einzigartigen Peptid-MHC-Komplexe diktieren, ob eine T-Zell-Apoptose durchlaufen wird, Anergie, Aktivierung, Differenzierung, Zytokinproduktion oder Zytotoxizität. Jedoch aufgrund der großen TCR-Repertoire, Analyse, wie ein spezifischer TCR zu einem bestimmten Antigen zu reagieren erfordert die Verwendung von einzelnen TCR-Systeme.
Verschiedene TCR transgene Mäuse wurden erzeugt , um die Funktion eines einzelnen TCR in einem in vivo – Modell 3-9 zu studieren. Es gibt jedoch Einschränkungen transgenen Mäusen einschließlich der TCRKosten, die Länge der Zeit eine einzelne transgene Maus und die so genannte Gründereffekt von zufälligen Transgen – Insertion in die Keimbahn DNA 10 zu erzeugen. Daher relativ wenige TCR transgene Mäuse wurden für jede gegebene Antigen und die funktionellen Auswirkungen von hohen und niedrigen TCR-Affinität für das gleiche Epitop gerichtet werden selten erzeugt. Um die Notwendigkeit für eine schnelle Annäherung an Bildschirm – Adresse und mehrere TZR einzeln oder in Kombination, retrogenic ( 'retro' von Retrovirus und "gene" von transgenen) Mäuse wurden als Alternative genutzt studieren 11-13 transgene Mäuse zu TCR.
Die 2A Peptid Konsensusmotiv innerhalb von mehreren Viren gefunden bestehen aus einer 2A-Asp-Val / Ile-Glut-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, bei der Spaltung zwischen dem Glycin der 2A und dem Prolin der 2B auftritt von cis – aktiven Hydrolase – Aktivität, was zu einer ribosomalen Skipping bei der Übersetzung 10,14-16. Für eine detaillierte Darstellung der c darstelltlaub der verschiedenen 2A Peptide (F2A, E2A, T2A und P2A) finden Sie auf Referenzen 10 – 12. Auf diese Weise zwei Cistrons (TCR alpha und TCR beta) können in einem einzigen Vektor was in stöchiometrischen Übersetzung verknüpft werden. Unter Verwendung dieses Ansatzes können wir zum Ausdruck bringen und direkt mehrere Antigen – spezifischen TZR in vivo vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dem Protokoll wir ausführlich einige kritische Schritte optimale Knochenmark Gesundheit, Transduktionseffizienz und Rekonstitution zu gewährleisten. Erster wichtiger Schritt ist die Erzeugung und die ordnungsgemäße Wartung der GP + E86 Virusproduzentenzellen. Verwenden frühen Passage Produktionszelllinien und halten bei 80% Konfluenz oder niedriger vor der Verwendung. Wenn frisch machen viralen Produzentenzellen GP + E86, sicherzustellen, sind die 293T-Zellen frühen Passage und wachsen in der Kultur für 24 bis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus NIH (5K22A1119151-01 und 1R56DK104903-01) zu MLB, Pilot / Machbarkeits Programm des Diabetes Research Center (P30-DK079638) bei BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA unterstützt 1-15-JF-07, AAI Karriere in Immunology Fellowship MB und The Robert und Janice McNair-Stiftung.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ‘cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ‘skip’. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
