T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

요약

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

초록

전반적으로, T 세포 유착, 면역 시냅스 형성 항원 제시 세포 (APC)와 상호 작용 및 염증 부위로 세포 모집 고유 프로세스에 기여 함수의 중요한 구성 요소이다. T 세포의 혈관 작용은 순환 자체에 의해 발생되는 전단 응력에 의해 도전하는 동안 T 세포 유착이 두 상황은 휴대 APC 상호 정적으로 간주 될 수있는 T 다르다. T 세포 APC 상호 작용은 두 개의 휴대 파트너가 서로 정적 상대적 점에서 정적으로 분류하고 있습니다. 일반적으로, 이러한 상호 작용이 임파절 내에서 발생한다. T 세포가 혈관의 벽과 상호 작용으로 세포를 구속하고 생성 된 전단 응력에 저항해야한다. ^-1,2- 이러한 차이는 더 두 가지 규정하는 처리와 유동 조건에서 고정 부착 및 접착 성 증진의 필요성을 강조. T 세포 접착의 조절이 가장 간결 단점이라고 할 수있다세포 표면에 발현 분자 인테그린과 상호 작용하여 세포의 표면에 발현되는 접착 분자 인테그린 리간드의 상호 작용을 조절하는 친 화성 상태 조업. 인테그린 선호도 상태의 규제의 우리의 현재 이해는 체외 모델 시스템에서 종종 단순한에서 온다. 접착 여기서 설명 유동 조건을 사용하여 분석하고 시각화 자극 다음 실시간 T 세포 상피 세포 상호 작용의 정확한 정량을 허용한다. 유동 검정 하에서 접착 저해 또는 자극 물질로 처리 다음 T 세포 내 시그널링 밀착성 시험에 적용될 수있다. 또한,이 분석은 접착제 백혈구 집단 및 인테그린 접착 분자 쌍 T 세포 신호 전달을 넘어 확장 될 수있다.

서론

T 림프구 접착 성 T 세포 트래 피킹 및 항원 제시에 중요한 역할을 수행하는 ³ 건강한 면역 시스템의 고유 프로세스들을 중재한다. 면역 감시 또는 접착이 두 가지 역할이 중요한 활성 면역 반응 동안의 여부. ⁴ T 세포 - 내피 세포 상호 작용의 생리 학적 신호 이벤트 (APC) 상호 셀 제시 T 세포 항원을 구별하고, 따라서의 구분 방법을 필요 연구는 가장 관련된 신호 폭포를 이해합니다. 림프구 넘쳐 중에 혈관 벽에 대한 T 세포의 밀착성 신속한 동적 인테그린 활성화를 필요로한다. 내피 따라 액티브 상태 인테그린 접착 분자 간의 긴밀한 상호 작용은 T 세포가 세포 통로 허용 영역 검색에 표면을 따라 기어 있도록 혈류에 강한 접착력을 이끈다. ⁵ T 세포의 Bi 크롤링 -directionally 아론GA 혈관벽은 T 세포의 구별 접착제 선단부와 편광 접착시에 ^{의존한다.도 6은} 가장 중요한 것은, 밀착성 및 윤회 혈류 순환에 의해 발생되는 전단력에 대한 저항을 요구한다.

림프구 접착력을 연구하는 실험을 설계 할 때,주의가 관심있는 특정 자극에 지불해야한다. 인테그린 활성화하는 T 세포 유착 모든 형태의 일반적이고 중요한 요소이지만, 활성화 캐스케이드의 개별 수용....

프로토콜

1. 도금 CHO-ICAM 세포

주 :이 단계의 목적은 합류 단층을 생성하는 것을 목표로 밤새 성장 유동 챔버의 CHO-ICAM 세포 플레이트이다.

1. 5 %, 37 ℃에서 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (CHO-ICAM 완전 배지)로 보충 된 10 ml의 RPMI 배지에서 10cm 조직 배양 처리 된 배양 접시에서 CHO-ICAM 세포 유지 CO _2.
2. 세포를 수집하기 위해, 1 ml의 0.5 % 트립신 EDTA를 추가하고 온화한 진탕 1 분 동안 실온에서 배양한다. 미디어의 4 ml의 트립신을 중화.
3. hemacytometer를 사용하여 CHO-ICAM 세포를 계산하고 챔버 당 0.75 × 10 ⁵ 세포를 계산합니다. 참고 :이 실험에서 : 2.25 × 10 ⁵ 세포 3 실 시드 필요합니다.
4. 원심 0.75 × ¹⁰⁵ CHO-ICAM의 500 XG, 실온에서 5 분 동안 실 당 세포 및 CHO의 챔버 당 30 μL의 세포 펠렛을 재현 탁-ICAM 전체 문화 미디어.
   참고 :이 실험에서는 90 μl의 3 챔버 시드 필요합니다.
5. 천천히 유량 용기의 한 저수지로 세....

결과

나타낸 바와 같이, 대표적인 결과 SDF-1α 자극, 주르 케트 일차 인간 CD3 ⁺ T 세포를 사용하여 유동 부착 분석법에서 도시된다. 모든 도시 실험에서 음성 대조군은 무 자극 세포이다. 자극되지 않은 셀의 문턱 기저 %의 밀착성 5 사이 - 10 %; 특히이 범위에서 상기 기재의 밀착성이 문제가 실​​험을 나타내고 T 세포의 시작 인구 비특이적 제제에 미리 활성화 하였다 나왔다. 자극되지 않은 세포의 위에 각 조건에서의 포스트 플로우 %의 밀착성의 계산에 더하여 계산 될 수 접착 세포 수의 증가를 접어. 이 두 가지 계산 방법을 나타내는 데이터는 여기에 포함된다.

도 2a는 각 조건의 전후의 유동 흐름 챔버 내의 필드를 나타내는 이미지를 나타낸다. 실험에 앞서, 주르 케트 (쇼n은 그림 2A.......

토론

올바르게 T 세포 유착을 분석하기 위하여, 자극은 시험관 내 방법을 선택할 때 고려되어야 연구에 포함된다. LFA-1의 활성화 및 바인딩 ICAM-1에 이르는 신호를 연구하는 여러 가지 분석이 있지만 모든 방법이 서로 호환되지 않습니다. 정적 접착 분석 ^(10)는 최적의 T 세포 APC의 상호 작용을 연구하는 데 적합하다; 대안으로, 여기에 설명 된 전단 응력 방법은 T 세포 상피 세포의 상호 작용을 모델링하기에 이상적이다. 생체 내, 케모카인 단단히 부착 및 혈액의 전단 응력은 ^{14, 15,} 흐름 저항에 의해 응답해야 T 세포 롤링, 내피 함께 제공됩니다있다. 이런 이유로, 케모카인 시그널링의 연구는 전단 응력을 통합 한 분석에서 연구 될 것이 가장 적합하다. 유동 조건을 사용하여이 접착의 주요 장점은 T 세포와 인테그린과의 상호 작용을 모델링 단순하다. 이 분석은 매우 독특한 기능과 기계적 결합하나 인테그린 접착 분자 쌍의 연구 환경을 모델링하여 연구........

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
T 세포 샘플(세포주 또는 일차)	ATCC	TIB-152	말초 인간 T 세포
CHO-ICAM-1 세포	ATCC	CRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreat	ibidi	80606
500ml 유리병	Fisher	FB800500
250ml 유리병	Fisher	FB800250
실리콘 튜빙 0.8mm	ibidi	10841
인큐베이터 챔버가 있는 컨포칼 현미경	Ziess	700	모든 광시야 형광 현미경
주사기 펌프	New Era 펌프 시스템	NE-300
60ml 주사기	BD	309653
CFSE	eBioscience	65-0850
SDF-1α	R& D	350-NS-010/CF
RPMI	론자	12-702F/12
PBS	Lonza	17-516F
마이크로 원심분리기	Eppendorf	5424
D-글루코스	시그마 알드리치	G8270
PMA	Sigma Aldrich	16561-29-8
Volocity 소프트웨어	Perkin Elmer	버전 6.2.1
ImageJ 소프트웨어	NIH	버전 1.48V
조직 배양 처리 배양 접시	Falcon	353003
Trypsin-EDTA (0.25 %) Phenol Red	Gibco 25200114
Heat Inactivated FBS	덴빌	FB5001-H
페니실린/스트렙토마이신	피셔	BP295950