Fémur Fenêtre Chambre Modèle pour<em> In Vivo</em> Suivi des cellules dans la moelle osseuse murine
Summary
The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.
Abstract
Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.
Introduction
La moelle osseuse est un organe important impliqué dans l'hématopoïèse et la régulation immunitaire. Il se compose d'un composant hématopoïétique contenant des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (hspC), et un composant de stroma contenant des cellules progénitrices non hématopoïétiques qui donnent naissance à des cellules mésenchymateuses 1. Deux tiers de l' activité hématopoïétique est dédié à la génération de cellules myéloïdes 2. En particulier, un grand nombre de neutrophiles sont produites dans la moelle osseuse, avec 1-2 x 10 cellules 11 produites par jour chez un humain adulte normal 2. Les neutrophiles sont la première ligne de défense contre les infections microbiennes et sont principalement réservés dans la moelle osseuse jusqu'à ce que le stress déclenche leur mobilisation pour compléter les neutrophiles périphériques 1,3. En plus de leurs effets anti-microbiens, des études récentes suggèrent un rôle important de neutrophiles dans la biologie du cancer, ayant à la fois pro- et anti- tumorigène phénotypes en fonction de la croissance transformantfacteur bêta (TGF-β) de signalisation dans le 4,5 microenvironnement de la tumeur. Par ailleurs, des études ont montré que les neutrophiles qui accumulent dans les tumeurs primaires exercent des effets pro-tumorigènes et métastatiques en supprimant la fonction cytotoxique des lymphocytes T 6,7, tandis que les neutrophiles en circulation exercent un cytotoxique, un effet anti-métastatique 8. En tant que tel, enquête sur les cellules hématopoïétiques de la moelle osseuse, en particulier des neutrophiles, est cruciale pour élucider leur rôle dans la régulation immunitaire et la tumeur.
Histopathologie et un dénombrement complet du sang périphérique sont couramment utilisés pour évaluer les altérations cellulaires et structurelles dans la moelle osseuse 9. Cependant, ces procédés ne fournissent que des informations statiques de différentes populations cellulaires ou des microstructures de tissu. Longitudinale imagerie in vivo peut être utilisé en combinaison avec les méthodes standard pour évaluer la dynamique de plusieurs cellules, vasculaires et stromales, ainsi que des composants de cellule à cinteractions ell de manière longitudinale. Microscopie intravitale (IVM), définie comme l' imagerie d'animaux vivants à une résolution microscopique 10 est particulièrement utile pour l' évaluation des processus cellulaires dynamiques au cours du temps dans un même échantillon, ce qui réduit le nombre d'animaux d' expérimentation nécessaire. IVM est souvent combiné avec une chambre de fenêtre chroniquement transplanté (WC) pour accéder à l'organe d'intérêt pour l'imagerie sur une durée de quelques semaines ou mois. modèles WC crâniennes et dorsale-skinfold ont la plus longue histoire d'utilisation qui remonte au milieu des années 1990. Plus récemment, d' autres modèles de WC spécifiques d'organes , tels que ceux du coussinet adipeux mammaire et les divers organes de l' abdomen ont été développés 11.
L'approche typique pour l' imagerie de la moelle osseuse in vivo est exposée principalement impliquée de la calvaria de souris, où l'os amincie permet la visualisation directe des cellules individuelles avec une intervention chirurgicale minimale 12-14. Cependant, l'os calvarial osseuse peut be distinct de celui des autres os, tels que l'os long, tel que démontré par un nombre inférieur de HSPCs et les cellules hypoxiques dans calvaria, qui indique le maintien et le développement de HSPCs 15 réduite. Par conséquent, des approches alternatives pour l'évaluation des composants cellulaires dans l'os long ont été étudiés. Ceux – ci comprennent l' exposition directe de l'os fémoral osseuse 16 et de la transplantation ectopique du fémur scission du dorsale skinfold WC 17. Cependant, la première est une procédure de terminal qui ne permet pas le suivi des altérations cellulaires, structurelles et fonctionnelles sur des périodes de temps plus longues, et le second probablement perturbe le fonctionnement normal de la moelle osseuse en raison de la transplantation du fémur à un site ectopique à l'intérieur du WC dorsale du pli cutané. Une autre méthode qui permet une imagerie en série orthotopique de la moelle osseuse du fémur au cours du temps est l'utilisation d'un WC dans l'os du fémur. Un rapport précédent a démontré l'imagerie à long terme de la microcirculation dans l'os fémoral osseuse au moyen d'unfémur WC chez les souris 18. En outre, les auteurs ont démontré la visualisation des cellules tumorales dans le fémur, ce qui indique son utilité dans la métastase de la moelle osseuse de surveillance. Cependant, cette conception de WC est limitée par sa grande taille (1,2 cm de diamètre) et relativement petite surface d'imagerie (4 mm de diamètre), qui est uniquement pour la grande souris (26-34 g, 3-6 mois), ce qui rend le approche pratique pour une utilisation de routine.
Par conséquent, un nouveau WC avec une taille globale plus petite et la plus grande surface d'imagerie interne a été conçue dans le but de la présente étude. Le but de cette étude était de fournir un procédé pour imager différents types de cellules dans la moelle osseuse du fémur. Le modèle de WC du fémur a été développé en interne et a été utilisé pour visualiser et suivre neutrophiles dans le réseau vasculaire 3D. En utilisant ce modèle, MIV de la moelle osseuse peut être réalisée en série sur 40 jours. Cette approche peut être appliquée à une variété de domaines pour élucider les processus de l'hématopoïèse, une régulation immunitairele développement de la tumeur nd.
Protocol
Representative Results
Discussion
En temps réel, l'imagerie en série des processus cellulaires dynamiques dans la moelle osseuse contient des informations qui est par ailleurs difficile à obtenir en utilisant des techniques classiques telles que l'histologie et la numération totale du sang. Le modèle de WC du fémur décrit ici offre des occasions uniques pour enquêter sur des altérations cellulaires et structurelles dans la moelle osseuse au fil du temps. Bien qu'un modèle fémur WC a été indiqué précédemment, notre nouvelle co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le Fonds avancée Microscopie optique (de www.aomf.ca) au Réseau universitaire de santé de l'aide à la microscopie, et M. Jason Ellis de la princesse Margaret Cancer Center Machine Shop pour la fabrication du WC et l'étape d'imagerie. Nous tenons également à remercier le Dr Iris Kulbatski pour l'édition de manuscrits.
Materials
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height) |
| Coverglass (8mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
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