대한 대퇴골 창 회의소 모델<em> 생체</em쥐의 골수에서> 셀 추적
Summary
The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.
Abstract
Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.
Introduction
골수는 조혈 및 면역 조절에 관여하는 중요한 기관이다. 이는 조혈 줄기 및 전구 세포 (HSPCs)를 함유하는 성분으로 구성 조혈 및 중간 엽 세포 하나를 야기 비 조혈 전구 세포를 포함하는 기질 성분. 조혈 활동 3 분의 2는 골수 세포 2의 생성에 전념하고 있습니다. 1-2 × 10 11 세포는 정상적인 인간 성인이 하루 당 생성에 특히 호중구의 다수는 골수에서 생성된다. 호중구는 미생물 감염에 대한 방어의 첫 번째 줄에있는 스트레스가 주변 호중구 1,3-을 보완하기 위해 자신의 동원을 트리거 할 때까지 주로 골수에서 예약되어 있습니다. 그 항균 효과에 더하여, 최근의 연구에 따라 바뀌는 성장 프로 및 항 종양 표현형 모두 갖는 암 생물학에서 호중구의 주요 역할을 시사종양 미세 환경의 4,5에 신호 인자 베타 (TGF-β). 또한, 연구는 순환 호중구 세포 독성, 항 전이 효과를 발휘하면서 8 차 종양에 축적 호중구, T 세포의 세포 독성 -6,7- 기능을 억제함으로써 프로 종양 및 전이성 영향을 미치는 것을 설명했다. 이와 같이, 골수의 조혈 세포, 특히 호중구의 조사가 종양 면역 조절의 역할을 밝히기에 중요하다.
조직 병리학 및 전체 말초 혈액 카운트는 정기적으로 골수 구 셀룰러 및 구조적 변화를 평가하기 위해 사용된다. 그러나, 이들 방법은 단지 다른 세포 집단 또는 조직의 미세 구조의 정적 인 정보를 제공한다. 생체 내 이미징 종 세포에서 C뿐만 아니라 여러 세포, 혈관 및 간질 성분의 동역학을 평가하기 위해 표준 방법을 병용 할 수있다길이 방식으로 엘 상호 작용. 미세한 분해능 10 살아있는 동물의 생체 내에 촬상 정의 현미경 (IVM)는, 동일한 샘플 시간에 걸쳐 동적 세포 과정을 평가할 필요 실험 동물의 수를 감소하는데 특히 유용하다. IVM은 종종 주 개월의 기간에 걸쳐 이미징 관심의 기관에 액세스 할 수있는 만성적 이식 윈도우 실 (WC)와 결합된다. 두개골과 지느러미 – 피부 집계 WC 모델은 다시 1990 년대 중반까지 거슬러 올라가는 사용의 긴 역사를 가지고 있습니다. 최근 이러한 유방 지방 패드 및 다양한 복부 장기의 것과 다른 기관 특이 WC 모델 (11)이 개발되었다.
생체 내에서 골수 이미징의 일반적인 접근 방식은 얇은 뼈가 최소한의 수술 적 치료 12-14 단일 세포의 직접 시각화를 가능하게 마우스의 덮개 뼈, 주로 참여 노출을 보유하고 있습니다. 그러나, 두개골 골수 ㄱ 수도E HSPCs (15)의 유지 보수 및 개발 감소 나타낸다의 두개골에 HSPCs 저산소 세포의 낮은 숫자에 의해 입증 된 바와 같이, 이러한 긴 뼈 다른 뼈의 구별. 따라서, 긴 뼈의 세포 구성 요소를 평가하기위한 다른 방법을 조사하고 있습니다. 다음은 대퇴 골수 (16)의 직접적인 노출과 등쪽 피부 집계 WC (17)의 분할 대퇴골의 이소성 이식을 포함한다. 그러나, 전자는 더 긴 기간에 걸쳐, 셀룰러 구조적 및 기능적 변화를 추적하는 것을 허용하지 않는 터미널 절차이고, 후자의 가능성 때문에 등쪽 피하 지방 WC 내부 자궁외 사이트 대퇴골 이식 정상적인 골수 기능을 방해한다. 시간이 지남에 따라 대퇴골 골의 소성을 연속 촬영을 가능하게하는 또 다른 방법은 대퇴골의 WC의 사용이다. 하나의 이전 보고서는를 사용하여 대퇴 골수 미세 장기 영상을 보여쥐 18 WC를 대퇴골. 또한 저자는 모니터링 골수 전이에서의 유틸리티를 나타내는 대퇴골에서 종양 세포의 가시화를 보여 주었다. 그러나,이 WC 설계가 큰 마우스 (26-34g 나이 3-6 개월)에만 적합했다 대형 사이즈 (1.2 cm 직경)과 상대적으로 작은 이미징 영역 (4mm 직경)에 의해 제한되었다함으로써 제조 일상적인 사용을위한 실용적 접근.
따라서, 작은 전체 크기 새로운 WC 큰 내부 이미징 영역이 연구의 목적으로 설계되었다. 본 연구의 목표는 대퇴골 골 다양한 세포 유형을 묘화 방법을 제공하는 것이다. 대퇴골의 WC 모델은 자체 개발하고, 3D 혈관 네트워크 내에서 호중구를 시각화하고 추적하는 데 사용되었다. 이 모델을 이용하여, 골수 IVM 40 일간 연속적으로 수행 할 수있다. 이 방법은 면역 조절 A를 조혈 과정의 해명을위한 다양한 분야에 적용될 수있다차 종양 개발.
Protocol
Representative Results
Discussion
실시간 골수에서 동적 세포 과정의 일련 촬상 그렇지 같은 조직학 총 혈구와 같은 종래 기술을 이용하여 수득 도전 정보를 제공한다. 여기에 설명 된 대퇴골 WC 모델은 시간에 따른 골수 세포 및 구조적 변화를 조사하는 독특한 기회를 제공한다. 대퇴골의 WC 모델은 이전에보고되었지만, 우리의 새로운 디자인 성인 마우스에 사용하기위한 더 호환도 작아 WC 전체 크기의 큰 이미지 필드를 제공한다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 현미경과 지원을 대학 건강 네트워크의 고급 광학 현미경 시설 (www.aomf.ca)를 감사하고, 화장실, 이미징 단계의 제조 프린세스 마가렛 암 센터의 기계 공장에서 씨 제이슨 엘리스 것이다. 우리는 또한 원고 편집 박사 아이리스 Kulbatski에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| NRCNU-F athymic nude mice | Taconic | Ncr nude | 8-10 weeks old, female |
| Saline | Baxter | JB1302P | |
| Ketamine hydrochloride | Bioniche Animal Health Canada, Inc. | DIN 01989529 | |
| Xylazine | Bayer HealthCare, Bayer Inc. | DIN 02169592 | |
| Surgical drape | Proxima | DYNJP2405 | |
| Electric heating pad | Life Brand | 57800827375 | |
| Stereomicroscope | Leica | Leica M60 | |
| Eye ointment (tear gel) | Novartis | T296/2 | |
| 7.5% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-151-16 | |
| 70% isopropyl alcohol | GreenField | P010IP7P | |
| 10% betadine | Purdue Frederick Co | 67618-150-05 | |
| Scalpel handle (#3) | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scalpel blade (#15) | VWR | 89176-368 | |
| Spring Scissors curved | Fine science Tools | 15023-10 | |
| Baby-Mixter Hemostat | Fine science Tools | 13013-14 | |
| Fine Scissors | Fine science Tools | 14094-11 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | Fine science Tools | 11151-10 | |
| Halsted-Mosquito Hemostats | Fine science Tools | 13008-12 | |
| Micro-drill | Harvard Apparaus | 72-6065 | |
| Micro-drill burrs | Fine Science Tools | 19007-14 | |
| Femur window chamber | PMCC machine shop | custom design | 9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness) |
| U-shaped bar | PMCC machine shop | custom design | 13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height) |
| Coverglass (8mm) | Warner Instruments | HBIO 64-0701 CS-8R | |
| Retaining ring (8mm) | ACKLANDS GRAINGER | UNSPSC # 31163202 | |
| Nuts (hexagon stainless steel) | Fastenal | 70701 | |
| Dental cement | 3M | RelyX U200 | |
| Suture (5-0 Monosof black) | Covioien | SN-5698 | |
| Halsey needle holder | Fine Science Tools | 12501-13 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Reckitt Benckiser | DIN 0281251 | |
| Meloxicam (Metacam) | Boehringer Ingelheim | DIN 02240463 | |
| Amoxicillin (Clamavox) | Pfizer | DIN 02027879 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD2000S | |
| APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1) | eBioscience | 17-9668 | |
| Two-photon microscope LSM 710 | Carl Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | |
| Imaging stage | PMCC machine shop | custom design | 15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height) |
| Imaris software | Bitplane | Imaris 8.0 | Image analysis software described in Section 3 of the Protocol |
| Zen 2012 | Zeiss | Zen 2012 | Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol |
References
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