Fémur Window Cámara Modelo de<em> En Vivo</em> Seguimiento de la célula de la médula ósea murina

Summary

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

Abstract

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Introduction

La médula ósea es un órgano importante que participa en la hematopoyesis y la regulación inmune. Se compone de un componente hematopoyético que contiene las células madre y progenitoras hematopoyéticas (hspCs), y un componente del estroma que contiene células progenitoras no hematopoyéticas que dan lugar a células mesenquimales ^1. Dos tercios de la actividad hematopoyética se dedica a la generación de células mieloides ^2. En particular, un gran número de neutrófilos se producen en la médula ósea, con 1-2 x 10 ¹¹ células generadas por día en un ser humano adulto normal ^2. Los neutrófilos son la primera línea de defensa contra las infecciones microbianas y son en su mayoría reservados en la médula ósea hasta que el estrés desencadena su movilización para complementar los neutrófilos periféricos ^1,3. Además de sus efectos anti-microbianos, estudios recientes sugieren un papel importante de los neutrófilos en la biología del cáncer, que tiene tanto pro- y anti-fenotipos tumorigénicos en función de crecimiento transformantefactor beta (TGF-β) de señalización en el ^4,5 microambiente tumoral. Por otra parte, los estudios demostraron que los neutrófilos que se acumulan en los tumores primarios ejercen efectos pro-tumorigénicas y metastásicas mediante la supresión de la función citotóxica de las células T ^6,7, mientras que los neutrófilos en circulación ejercen un efecto citotóxico anti-metastásico ^8. Como tal, la investigación de las células hematopoyéticas en la médula ósea, en particular los neutrófilos, es crucial para la aclaración de su papel en la regulación inmune y tumor.

Histopatología y un recuento completo de sangre periférica se utilizan habitualmente para evaluar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea ^9. Sin embargo, estos métodos sólo proporcionan información estática de diferentes poblaciones de células o de tejidos microestructuras. Longitudinal de imágenes in vivo se puede utilizar en combinación con los métodos estándar para evaluar la dinámica de múltiples componentes celulares, vasculares y del estroma, así como la célula a-cell interacciones de manera longitudinal. Microscopía intravital (IVM), definido como formación de imágenes de animales que viven en la resolución microscópica ^10, es particularmente útil para la evaluación de los procesos celulares dinámicos en el tiempo en la misma muestra, lo que reduce el número de animal experimental requerido. IVM se combina a menudo con una cámara de ventana trasplantado crónicamente (WC) para acceder al órgano de interés para obtener imágenes de más de una duración de semanas a meses. modelos WC craneal y dorsal-pliegue de la piel tienen la más larga historia de uso se remonta a mediados de la década de 1990. Más recientemente, otros modelos de WC de órganos específicos, tales como las de la almohadilla de grasa mamaria y varios órganos abdominales se han desarrollado ^11.

El enfoque típico para obtener imágenes de la médula ósea in vivo tiene la exposición participa principalmente de la bóveda craneal de ratones, donde el hueso adelgazada permite la visualización directa de las células individuales con una intervención quirúrgica mínima ^12-14. Sin embargo, la médula ósea de calota puede be distinta de la de otros huesos, tales como el hueso largo, como se demuestra por un menor número de HSPCs y células hipóxicas en bóveda craneal, lo que indica mantenimiento y desarrollo de HSPCs ¹⁵ reduce. Por lo tanto, se han investigado enfoques alternativos para evaluar los componentes celulares en el hueso largo. Estos incluyen la exposición directa de la médula ósea del fémur ¹⁶ y el trasplante ectópica de fémur fractura en el pliegue cutáneo dorsal ¹⁷ WC. Sin embargo, el primero es un procedimiento del terminal que no permite el rastreo de alteraciones celulares, estructurales y funcionales durante períodos de tiempo más largos, y el segundo probable perturba la función normal de la médula ósea debido a el trasplante de fémur a un sitio ectópico en el interior del WC dorsal del pliegue cutáneo. Otro método que permite formación de imágenes de serie ortotópico de médula ósea femoral en el tiempo es el uso de un WC en el hueso femoral. Un informe anterior demostró imágenes a largo plazo de la microcirculación en la médula ósea del fémur usando unaWC fémur en ratones ^18. Adicionalmente, los autores demostraron la visualización de las células tumorales en el fémur, lo que indica su utilidad en la metástasis ósea de monitoreo hueso. Sin embargo, este diseño WC estaba limitado por su gran tamaño (1,2 cm de diámetro) y área de imagen relativamente pequeña (4 mm de diámetro), que fue sólo es adecuado para los ratones grandes (26 a 34 g, de 3-6 meses de edad) con lo que el acercarse poco prácticos para su uso rutinario.

Por lo tanto, un nuevo WC con un tamaño general más pequeño y el área de formación de imágenes interno más grande fue diseñada con el propósito de este estudio. El objetivo de este estudio era proporcionar un método para obtener imágenes de diversos tipos de células en la médula ósea femoral. El modelo WC fémur fue desarrollado internamente y se utiliza para visualizar y realizar un seguimiento de los neutrófilos dentro de la red vascular 3D. Usando este modelo, IVM de la médula ósea se puede realizar en serie de más de 40 días. Este enfoque se puede aplicar a una variedad de campos para elucidar los procesos de la hematopoyesis, la regulación inmune unand el desarrollo de tumores.

Protocol

NOTA: Todo el trabajo con animales se llevó a cabo bajo el protocolo # 2615 aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Health Network. 1. Preparación quirúrgica de ratón Antes de la cirugía, esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos y la cámara de ventana (WC) por tratamiento en autoclave. Complementar el agua potable con 50 mg / kg de peso corporal de amoxicilina 2 días antes de la cirugía. Inyectar el ratón con 0,1 mg / kg de peso corporal de …

Representative Results

Murino médula ósea femoral se accede con éxito utilizando el WC para permitir la visualización de los neutrófilos individuales y redes vasculares. La figura 1 muestra el instrumento WC y se describe el procedimiento quirúrgico, que consiste en la exposición del hueso femoral y el adelgazamiento de hueso cortical para obtener acceso óptico dentro de la hueso. La cirugía es bien tolerado en ratones; que se evaluaron para las reacciones físicas adversas, tales com…

Discussion

En tiempo real, de imágenes en serie de los procesos celulares dinámicos en la médula ósea proporciona información que de otro modo un reto para obtener usando técnicas convencionales tales como la histología y los recuentos sanguíneos totales. El modelo WC fémur descrito aquí ofrece oportunidades únicas para investigar las alteraciones celulares y estructurales en la médula ósea con el tiempo. Aunque un modelo de fémur WC se ha informado anteriormente, nuestro nuevo diseño proporciona un campo de la imag…

Materials

NRCNU-F athymic nude mice	Taconic	Ncr nude	8-10 weeks old, female
Saline	Baxter	JB1302P
Ketamine hydrochloride	Bioniche Animal Health Canada, Inc.	DIN 01989529
Xylazine	Bayer HealthCare, Bayer Inc.	DIN 02169592
Surgical drape	Proxima	DYNJP2405
Electric heating pad	Life Brand	57800827375
Stereomicroscope	Leica	Leica M60
Eye ointment (tear gel)	Novartis	T296/2
7.5% betadine	Purdue Frederick Co	67618-151-16
70% isopropyl alcohol	GreenField	P010IP7P
10% betadine	Purdue Frederick Co	67618-150-05
Scalpel handle (#3)	Fine Science Tools	10003-12
Scalpel blade (#15)	VWR	89176-368
Spring Scissors curved	Fine science Tools	15023-10
Baby-Mixter Hemostat	Fine science Tools	13013-14
Fine Scissors	Fine science Tools	14094-11
Extra Fine Graefe Forceps	Fine science Tools	11151-10
Halsted-Mosquito Hemostats	Fine science Tools	13008-12
Micro-drill	Harvard Apparaus	72-6065
Micro-drill burrs	Fine Science Tools	19007-14
Femur window chamber	PMCC machine shop	custom design	9.1mm- 8.5mm- 7.5 mm (outer to inner diameter), 2.16 mm (radius of two holes), 13.9mm (distance between two holes), 0.7mm (thickness)
U-shaped bar	PMCC machine shop	custom design	13.8mm (length), 1.6 mm (width), 3.7mm (height)
Coverglass (8mm)	Warner Instruments	HBIO 64-0701 CS-8R
Retaining ring (8mm)	ACKLANDS GRAINGER	UNSPSC # 31163202
Nuts (hexagon stainless steel)	Fastenal	70701
Dental cement	3M	RelyX U200
Suture (5-0 Monosof black)	Covioien	SN-5698
Halsey needle holder	Fine Science Tools	12501-13
Buprenorphine (Temgesic)	Reckitt Benckiser	DIN 0281251
Meloxicam (Metacam)	Boehringer Ingelheim	DIN 02240463
Amoxicillin (Clamavox)	Pfizer	DIN 02027879
FITC-Dextran	Sigma-Aldrich	FD2000S
APC- Anti-Mouse Ly-6G (Gr-1)	eBioscience	17-9668
Two-photon microscope LSM 710	Carl Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO
Imaging stage	PMCC machine shop	custom design	15.9cm (length), 11cm (width), 0,9cm (height)
Imaris software	Bitplane	Imaris 8.0	Image analysis software described in Section 3 of the Protocol
Zen 2012	Zeiss	Zen 2012	Image acqusition software described in Section 2 of the Protocol