تحليل الدماغ الميتوكوندريا عن طريق المسلسل بلوك الوجه المجهر الإلكتروني
Summary
Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Abstract
العقل البشري هو المستهلكة للطاقة الجهاز العالية التي تعتمد أساسا على الجلوكوز كمصدر للوقود. وcatabolized الجلوكوز من الميتوكوندريا الدماغ عن طريق تحلل، مسارات حمض ثلاثي الكربوكسيلية (TCA) دورة والفسفرة التأكسدية (OXPHOS) لإنتاج الطاقة الخلوية في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). انخفاض قيمة إنتاج ATP الميتوكوندريا يسبب اضطرابات الميتوكوندريا، التي تمثل سريريا مع أعراض عصبية والعضلية بارزة. عيوب الميتوكوندريا موجودة أيضا في الاضطرابات العصبية النمائية (مثل اضطراب طيف التوحد) والاضطرابات العصبية (مثل التصلب العضلي الجانبي والزهايمر وأمراض باركنسون). وبالتالي، هناك اهتمام متزايد في الميدان لإجراء تحليل 3D من التشكل الميتوكوندريا والهيكل والتوزيع في إطار كل من الدول صحية والمرض. مورفولوجية الميتوكوندريا الدماغ متنوع للغاية، مع بعض الميتوكوندريا وبخاصة فيالمنطقة متشابك يجري في نطاق <200 نانومتر قطر، وهو أقل من الحد قرار من المجهر الضوئي التقليدي. معربا عن بروتين المستهدفة mitochondrially أخضر فلوري (GFP) في الدماغ يعزز إلى حد كبير في الكشف عن organellar بواسطة المجهر متحد البؤر. ومع ذلك، فإنه لا التغلب على القيود المفروضة على حساسية الكشف عن الميتوكوندريا صغيرة نسبيا الحجم دون oversaturating الصور الميتوكوندريا كبيرة الحجم. في حين التسلسلي المجهر الإلكتروني النافذ وقد استخدم بنجاح لتوصيف الميتوكوندريا في الخلايا العصبية المشبك، وهذا الأسلوب هو خصوصا عند مقارنة عينات متعددة تستغرق وقتا طويلا للغاية. وتنطوي هذه التقنية التسلسلي كتلة وجه مسح الإلكترون المجهري (SBFSEM) عملية مؤتمتة من باجتزاء، وكتل التصوير اكتساب الأنسجة والبيانات. هنا، ونحن نقدم بروتوكول لأداء SBFSEM من منطقة محددة من الدماغ القوارض لإعادة بسرعة وتصور مورفولوجيا الميتوكوندريا. هذه التكنولوجياويمكن أيضا أن تستخدم يت ضمن لتوفير معلومات دقيقة عن عدد الميتوكوندريا، وحجم والحجم والتوزيع في منطقة الدماغ محددة. منذ دقة وضوح الصورة التي تم الحصول عليها مرتفع (عادة أقل من 10 نانومتر) ويمكن أيضا يتم الكشف عن أي عيوب شكلية الميتوكوندريا الإجمالية.
Introduction
الميتوكوندريا هي عضيات الديناميكية التي تغير شكلها والمكان اعتمادا على العظة والاحتياجات الخلوية، في التفاعل مع ضيق الهيكل الخلوي الخلية، وردا على الأحداث الخلوية مثل التيارات الكالسيوم في الخلايا العصبية 1. الميتوكوندريا أيضا التفاعل مع العضيات الخلوية الأخرى مثل الشبكة الإندوبلازمية، الذي ينظم بدوره ديناميتها والتمثيل الغذائي 2. يظهر التشكل الميتوكوندريا عدم التجانس في أنواع مختلفة من الخلايا مثل. شكل عضية يختلف من أنبوبي إلى أن تتكون من صفائح، أكياس والأشكال البيضاوية 3. وقد تبين أن الميتوكوندريا الانصهار والانشطار البروتينات يمكن أن تنظم دورة في الموقع والحجم والشكل وتوزيع الميتوكوندريا 4. وعلاوة على ذلك، ترتبط التغييرات في شكل الميتوكوندريا مع التنكس العصبي، اللدونة العصبية، ضمور العضلات، مما يشير الى الكالسيوم، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلي وكذلك عمر وموت الخلايا تورط ثامورفولوجيا الميتوكوندريا تي خلية محددة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على وظيفة الخلوية العادية 5-11.
وظيفة الطاقة البيولوجية الرئيسية للالميتوكوندريا هي لتوليد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال تنفيذ سلسلة من التفاعلات الأيضية التي تنطوي على انهيار كامل من المواد المغذية (أي الجلوكوز، والدهنية والأحماض أو الأحماض الأمينية) من خلال دورة TCA وOXPHOS مسارات 12. يشكل الدماغ البشري 2٪ فقط من وزن الجسم إلا أنه يستهلك ~ 20٪ من إجمالي الطاقة المنتجة مما يجعل من الطاقة للغاية للمطالبة الجهاز 13. وبالتالي فإنه ليس من المستغرب أن ضعف الميتوكوندريا في البشر يؤدي إلى عدد كبير من مظاهر العصبية 14-17. الطفرات الوراثية في مكونات OXPHOS أن تنال يؤدي جيل ATP إلى اضطرابات الميتوكوندريا 17،18، وهي مجموعة غير متجانسة من الاضطرابات سريريا مع انتشار ~ 1: 5000 الأفراد، واحدة من أكثر الأسباب شيوعا للماضطرابات etabolic في الأطفال والبالغين. العجز للاعبي التنس المحترفين المستمدة من الميتوكوندريا يؤثر على أجهزة الجسم المتعددة ذات طاقة عالية مطالبين أجهزة مثل المخ والقلب والعضلات الهيكلية التي أثرت في الغالب في هؤلاء المرضى 14،17،18. في السنوات الأخيرة، وقد وفرت دراسات متعددة دليل على ضعف الميتوكوندريا في كل من الاضطرابات العصبية النمائية والاعصاب 15-17،19،20. منذ الميتوكوندريا ضرورية وحاسمة لنمو الدماغ ووظيفته، فإنه لا بد من وضع البروتوكولات التي يمكن تحليل التغيرات في الدماغ الميتوكوندريا التشكل، بنية، حجم وعددها وتوزيعها في إطار كل من الدول صحية والمريضة. وقد تم إنتاج نماذج الماوس مع استهداف mitochondrially البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتصور الحركات الميتوكوندريا والتعريب في الدماغ 21،22. في حين أن هذا هو أداة مفيدة للغاية لدراسة حركية الميتوكوندريا والتوزيع العام، هناك بعض السلبيات التي امبه محدود القرار، وحساسية المجهر مضان. هذه الصفات تجعل من الصعب تتبع الميتوكوندريا صغيرة نسبيا الحجم. وبالمثل، وقد استخدم المسلسل انتقال المجهر الإلكتروني بنجاح لعرض الميتوكوندريا متشابك 23، ولكن هذه الطريقة وقتا طويلا جدا. ومن المعروف التشكل الميتوكوندريا أن تكون ديناميكية للغاية لأنها تخضع لاستمرار الانشطار والانصهار دورات، وفي معظم خلايا الميتوكوندريا الحفاظ على شبكة متصلة غاية 24-26. الخلايا العصبية مستقطبة للغاية الخلايا مع التشعبات المتعددة ومحاور عصبية طويلة، والميتوكوندريا التي تشكل شبكة متصلة شبكي في خلايا الجسم قد تضطر إلى فصل لأنها تشق طريقها من خلال هذه neurites التي (الشكل 1). وهذا يجعل من الميتوكوندريا الدماغ متنوعة للغاية من حيث الحجم والشكل. على سبيل المثال، وذلك باستخدام التسلسلي كتلة وجه المجهر الإلكتروني (SBFSEM) تقنية، لاحظنا سابقا أن الفرق في حجم أو حجم mitochondr extrasynapticالجيش العراقي إلى الميتوكوندريا الموجودة في النهايات العصبية قد تكون بقدر أضعاف ستة عشر (27).
هناك عدة طرق لأداء حجم يحلل 28، والذي يتضمن المسلسل القسم تيم 29، الشريط الآلي جمع مشراح مستدق SEM 30، تركز أيون شعاع SEM 31، وSBFSEM 32. تحليل SBFSEM مزاياه في أن لديها القرار لتوفير البيانات الكمية على شكل صرفي، وحجم وتوزيع وعدد من العضيات مثل الميتوكوندريا في المناطق تصل إلى 1 ملم من الدماغ. العملية التقنية هي أيضا أقل تطلبا، مع الحصول على البيانات وتحليلها ضمن قدرات العديد من المعامل البيولوجية التي تفتقر إلى الخبرة EM السابقة. جعلت ظهور الأوراق التجارية لتوليد التسلسلية الصور الشبيهة قسم 3D تحليل التركيبية للأنسجة تقنية روتينية، الذي يسمح مزيد من التحليل الحجمي منحازة بطريقة سريعة ومتكررة 28 </سوب>. وقد وصفت SBFSEM الأولى والمستخدمة في مجال علم الأعصاب في عام 2004 32، استنادا إلى فكرة عرضته ليتون في عام 1981 33 دراسات متعددة منذ ذلك الحين وضعت هذه التقنية كأداة رئيسية في تحليل إعادة بناء الدوائر العصبية 34. وعلاوة على ذلك، للعديد من المشاريع الأصغر حجما، فإنه يوفر التحليل إعادة الإعمار لتحديد العضيات الخلوية 27،35-39. منذ ذلك الحين، وتستمد الصور تم الحصول عليها من الجهد المنخفض الإلكترونات مبعثر الظهر، وقد وضعت بروتوكولات تلطيخ الجديدة التي تجمع بين مختلف تقنيات تلوين المعادن الثقيلة المعروفة لزيادة دقة 40.
في هذه الورقة، ونحن نقدم بروتوكول لاستخدام 3D التصوير المجهر الإلكتروني والتحليل الحجمي الميتوكوندريا الدماغ على أساس الأساليب التي سبق استخدامها من قبلنا وغيرها 38،39،41. الطرق الأنسجة مرحلة ما بعد المعالجة المستخدمة وكما هو موضح سابقا من قبل Deerinck وآخرون40.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعقيد النظام العصبي يشكل تحديا كبيرا في إعادة كميات كبيرة الأنسجة وتحليل التشكل وتوزيع عضيات مثل الميتوكوندريا مع قرار مناسب. خلايا متعددة بما في ذلك الخلايا العصبية، الخلايا قليلة التغصن والخلايا النجمية مع العديد من العمليات الموسعة في ثلاثة أبعاد تتفاعل داخل أن…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
References
- Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
- Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
- Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
- Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
- Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson’s and Alzheimer’s disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
- Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
- Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
- Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
- Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd, V. A., Bohr, Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
- Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
- Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
- Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
- Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
- DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
- Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
- Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
- Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
- Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
- Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
- Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
- Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
- Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
- Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
- Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
- Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
- Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
- Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
- Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
- Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
- Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
- Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
- Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
- Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
- Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
- Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
- Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
- Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
- Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
- Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
- Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).
