JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
신경과학

Analyse af Brain mitokondrier Brug Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Published: July 09, 2016
doi:
10.3791/54214
, , , , ,
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Summary

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Abstract

Menneskelige hjerne er en høj energiforbrugende organ, der hovedsagelig er afhængig af glucose som en brændstofkilde. Glucose kataboliseres af hjernen mitokondrier via glycolyse, tri-carboxylsyre (TCA) cyklussen og oxidativ phosphorylering (OXPHOS) baner til at producere cellulær energi i form af adenosintriphosphat (ATP). Nedskrivning af mitokondrie ATP produktion forårsager mitochondriale lidelser, der udgør klinisk med prominente neurologiske og myopatiske symptomer. Mitokondriske defekter er også til stede i neurologiske forstyrrelser (f.eks autisme spektrum forstyrrelse) og neurodegenerative lidelser (f.eks amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers og Parkinsons sygdomme). Således er der en øget interesse inden for udførelse af 3D-analyse af mitokondrie morfologi, struktur og fordeling under både raske og sygdomstilstande. Hjernen mitokondrie morfologi er meget forskelligartet, med nogle mitokondrier især dem iden synaptiske region er i området på <200 nm diameter, hvilket er under opløsning grænse på traditionel lysmikroskopi. Udtrykker et mod mitokondrier målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) i hjernen forbedrer signifikant den organellar detektion ved konfokal mikroskopi. Det gør dog ikke overvinde begrænsninger på følsomheden af ​​påvisning af relativt lille størrelse mitokondrier uden oversaturating billeder af store mellemstore mitokondrier. Mens seriel transmission elektronmikroskopi er blevet anvendt til at karakterisere mitokondrier ved neuronal synapse er denne teknik meget tidskrævende, især når man sammenligner flere prøver. Det serielle blok-face scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknik indebærer en automatiseret proces med sektionering, imaging blokke af væv og data erhvervelse. Her giver vi en protokol til at udføre SBFSEM af et defineret område fra gnavere hjernen til hurtigt rekonstruere og visualisere mitokondrie morfologi. Denne technique kunne også bruges til at give nøjagtige oplysninger om mitokondrie nummer, volumen, størrelse og fordeling i et afgrænset område af hjernen. Da det opnåede billedopløsning er høj (typisk under 10 nm) kan også påvist grove mitokondriske morfologiske defekter.

Introduction

Mitokondrier er dynamiske organeller, som ændrer deres form og placering afhængig af de cellulære signaler og behov, i tæt interaktion med cellecytoskelettet, og som svar på cellulære begivenheder såsom calcium- strømme i neuroner 1. Mitokondrier også interagere med andre cellulære organeller fx endoplasmatisk reticulum, hvilket igen regulerer deres dynamik og stofskifte 2. Mitokondrie morfologi viser heterogenitet i forskellige celletyper ie. formen af organel varierer fra rørformet til, at der består af plader, sække og ovaler 3. Det er blevet vist, at mitokondrielle fusion og fission cyklus proteiner kan regulere placeringen, størrelsen, formen og fordelingen af mitokondrier 4. Endvidere er ændringer i mitokondrie formen er forbundet med neurodegeneration, neuronal plasticitet, muskelatrofi, calcium signalering, reaktive oxygenspecies generation samt levetid og celledød implicerer thaT-celle-specifik mitokondrie morfologi er kritisk for opretholdelse af normal cellulær funktion 5-11.

En væsentlig bioenergetic funktion af mitokondrier er at generere adenosintriphosphat (ATP) ved at udføre en serie metaboliske reaktioner, der involverer fuldstændig nedbrydning af næringsstoffer (dvs. glucose, fedt-syrer eller aminosyrer) via TCA-cyklus og OXPHOS Pathways 12. Den menneskelige hjerne udgør kun 2% af kropsvægten men det forbruger ~ 20% af den samlede energi, der produceres gør det til en yderst energikrævende organ 13. Det er derfor ikke overraskende, at mitokondriel dysfunktion hos mennesker fører til et stort antal neurologiske manifestationer 14-17. Genetiske mutationer i OXPHOS komponenter, der forringer ATP generation fører til mitochondriale lidelser 17,18, som er klinisk heterogen gruppe af sygdomme med en prævalens på ~ 1: 5.000 individer, og en af de mest almindelige årsag til metabolic lidelser hos børn og voksne. Underskud af mitokondrier-afledt ATP påvirker flere organsystemer med høj energi krævende organer såsom hjerne, hjerte og skeletmuskulatur bliver overvejende påvirket i disse patienter 14,17,18. I de senere år har flere undersøgelser fremlagt beviser for mitokondriel dysfunktion i både neurologiske og neurodegenerative sygdomme 15-17,19,20. Da mitokondrier er afgørende og kritisk for hjernens udvikling og funktion, er det bydende nødvendigt at udvikle protokoller, der kan analysere ændringer i hjernens mitokondrie morfologi, struktur, størrelse, antal og fordeling under både raske og syge tilstande. Musemodeller med mitokondrier målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) er fremstillet til at visualisere mitokondrie bevægelser og lokalisering i hjernen 21,22. Mens dette er et yderst nyttigt værktøj til at undersøge mitokondrie motilitet og generel fordeling, der er nogle ulemper, som omfatter en indee begrænset opløsning og følsomhed fluorescensmikroskopi. Disse egenskaber gør det vanskeligt at spore de relativt lille størrelse mitokondrier. Tilsvarende har seriel transmission elektronmikroskopi med held blevet anvendt til at se synaptisk mitokondrier 23, men denne metode er meget tidskrævende. Mitokondrie morfologi er kendt for at være meget dynamisk som de undergår kontinuerlig fission og fusion cyklusser, og i de fleste celler mitokondrier opretholde et højt tilsluttet netværk 24-26. Neuroner er stærkt polariserede celler med flere dendritter og udvidede axoner, og mitokondrier, der danner et tilsluttet retikulære netværk i cellen organ kan nødt til at adskille som de gør deres vej gennem disse neuritter (figur 1). Dette gør hjernen mitokondrier yderst varierede i størrelse og form. For eksempel ved anvendelse seriel blok-face scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknik, vi tidligere observeret, at forskellen i volumen eller størrelsen af ​​ekstrasynaptiske mitochondrIA til mitokondrier til stede i nerveender kan være så meget som seksten fold 27.

Der er flere muligheder for at udføre volumen analyser 28, som omfatter seriel sektion TEM 29, automatiseret tape indsamling ultramikrotom SEM 30, fokuseret ionstråle SEM 31, og SBFSEM 32. Den SBFSEM analysen har fordele i, at det har opløsningen til at give kvantitative oplysninger om den morfologiske form, størrelse, fordelingen og antallet af organeller såsom mitokondrier i områder op til 1 mm i hjernen. Den tekniske drift er også den mindst krævende, med dataopsamling og analyse inden for kapaciteter af mange biologiske laboratorier, der mangler tidligere EM oplevelse. Fremkomsten af kommercielle instrumenter til frembringelse serielle sektion-lignende billeder har gjort 3D ultrastrukturelle analyse af væv en rutinemæssig teknik, hvilket yderligere tillader en unbiased volumetrisk analyse på en hurtig og reproducerbar måde 28 </sup>. Den SBFSEM blev første gang beskrevet og anvendt inden for neurobiologi i 2004 32, baseret på en idé introduceret af Leighton i 1981 33. Flere undersøgelser har siden etableret denne teknik som et vigtigt redskab i genopbygningen analyse af neuronal kredsløb 34. Desuden er der for mange mindre projekter, det giver genopbygning analyse for at identificere cellulære organeller 27,35-39. Da er de erhvervede billeder stammer fra lav spænding tilbage scatter elektroner blev nye farvningsprotokoller som kombinerer forskellige kendte heavy metal farvningsteknikker udviklet til at øge opløsningen 40.

I dette papir, giver vi en protokol for at udnytte 3D-elektronmikroskopi billeddannelse og volumetrisk analyse af hjernens mitokondrier baseret på metoder, der tidligere har været anvendt af os og andre 38,39,41. De væv efterbehandling metoder blev som tidligere beskrevet af Deerinck et al40.

Protocol

Etik Statement: Procedurer, der involverer dyr fag er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) på Virginia Tech. Advarsel: Der skal træffes ekstreme forholdsregler ved håndtering og bortskaffelse flere komponenter, der anvendes i denne protokol. Før brug, skal den lokale institutionelle retningslinier samt sundhed og sikkerhed praksis etableres og følges, især for osmiumtetroxid, som er flygtige og ekstremt giftige, uranylacetat, som både er et tungmetal og kilde til radioaktivitet, og bly nitrat, s…

Representative Results

Vi viser, at hjernen mitokondrie morfologi og størrelse er heterogen i forskellige neuronale undersektioner. Konfokal mikroskopi på lave densitet neuronale kulturer transduceret med lentivirus udtrykker mitokondrier målrettet grønt fluorescerende protein viste, at mitokondrier bosiddende i neuronal soma danne et retikulære netværk, mens dem, der bor i distale neuritter udviser en diskret langstrakt morfologi (Figur 1 AB). Brug af SBFSEM teknikken, blev det mitokond…

Discussion

Kompleksiteten af ​​nervesystemet udgør en betydelig udfordring i at rekonstruere store væv mængder og analysere morfologi og distribution af organeller såsom mitochondrier med tilstrækkelig opløsning. Flere celler, herunder neuroner, oligodendrocytter og astrocytter med mange forskellige processer forlænget i tre dimensioner interagere i hjernevævet 43. Eftersom mitokondrier bor både i soma af celler og fjerne processer, mitokondrie morfologi er yderst pleomorfe i nervesystemet (figur 1)…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Materials

C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson’s and Alzheimer’s disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd, V. A., Bohr, Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Brain MitochondriaSerial Block-face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial MorphologyNeurodegenerative DisordersNeurodevelopmental DisordersSample PreparationStainingDehydrationEmbedding
check_url/kr/54214?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image