JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
신경과학

Analyse van de Brain Mitochondriën gebruik van Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Published: July 09, 2016
doi:
10.3791/54214
, , , , ,
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Summary

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Abstract

Menselijk brein is een hoge energie verbruikende orgaan dat voornamelijk is gebaseerd op glucose als brandstof bron. Glucose wordt gekataboliseerd door hersenen mitochondria via glycolyse, tri-carbonzuur (TCA) cyclus en oxidatieve fosforylering (OXPHOS) wegen om cellulaire energie te produceren in de vorm van adenosinetrifosfaat (ATP). Bijzondere waardevermindering van mitochondriale ATP productie veroorzaakt mitochondriale aandoeningen, die klinisch presenteren met prominente neurologische en myopathische symptomen. Mitochondriale gebreken zijn ook aanwezig in neurologische aandoeningen (bv autisme spectrum stoornis) en neurodegeneratieve aandoeningen (bijvoorbeeld amyotrofe laterale sclerose, de ziekte van Alzheimer en de ziekte van Parkinson). Aldus is er een toenemende belangstelling voor het gebied voor het uitvoeren van 3D analyse van mitochondriale morfologie, structuur en distributie onder gezond en ziektetoestanden. De hersenen mitochondriale morfologie is zeer divers, met een aantal mitochondria name inde synaptische gebied in het bereik van <200 nm diameter, hetgeen lager is dan de resolutielimiet van traditionele lichtmicroscopie. Uitdrukken van een op mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (GFP) in de hersenen aanzienlijk verbetert de organellen detectie met confocale microscopie. Dit betekent echter niet de beperkingen van de gevoeligheid van detectie van relatief kleinschalige mitochondria overwinnen zonder oversaturating de beelden van groot formaat mitochondria. Terwijl seriële transmissie elektronenmicroscopie is met succes gebruikt om mitochondriën karakteriseren de neuronale synaps, deze techniek is zeer tijdrovend vooral bij het vergelijken van meerdere monsters. De seriële blok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) techniek houdt een geautomatiseerd proces van snijden, imaging blokken van weefsel en data-acquisitie. Hier bieden we een protocol om SBFSEM uitvoeren van een bepaald gebied van knaagdieren hersenen om snel te reconstrueren en te visualiseren mitochondriale morfologie. deze technique kan ook worden gebruikt om nauwkeurige informatie over mitochondrial nummer, volume, grootte en verdeling in een bepaald hersengebied verschaffen. Omdat de verkregen beeldresolutie is hoog (meestal minder dan 10 nm) alle bruto mitochondriale morfologische defecten kunnen ook worden gedetecteerd.

Introduction

Mitochondriën zijn dynamische organellen die hun vorm en locatie afhankelijk van de cellulaire signalen en verandert zal in nauwe interactie met mobiele cytoskelet en als reactie op cellulaire gebeurtenissen zoals calcium stromen in neuronen 1. Mitochondriën ook een wisselwerking met andere cellulaire organellen, bijv endoplasmatisch reticulum, waardoor reguleert de dynamiek en metabolisme 2. Mitochondriale morfologie toont heterogeniteit in verschillende celtypen dwz. de vorm van het organel verschilt van die buisvormige bestaande uit platen, zakken en ovalen 3. Het is aangetoond dat mitochondriale fusie en splijtstofcyclus eiwitten de locatie, afmeting, vorm en verdeling van mitochondria 4 kan reguleren. Bovendien, veranderingen in mitochondriale vorm geassocieerd met neurodegeneratie, neuronale plasticiteit, spieratrofie, calcium signaaloverdracht, reactieve zuurstofspecies generatie en levensduur en celdood impliceert that celspecifieke mitochondriale morfologie essentieel is voor de handhaving van normale cellulaire functie 5-11.

Een belangrijke bio-energetische functie van de mitochondriën is om adenosine trifosfaat (ATP) te genereren door het uitvoeren van een reeks van metabole reacties die volledige afbraak van voedingsstoffen (ie glucose, vetzuren en aminozuren) via de TCA cyclus te betrekken en OXPHOS trajecten 12. Het menselijk brein vormt slechts 2% van het lichaamsgewicht maar het verbruikt ~ 20% van de totale energie geproduceerd, waardoor het een zeer energie veeleisende orgaan 13. Het is dan ook niet verwonderlijk dat mitochondriale dysfunctie bij de mens leidt tot een groot aantal neurologische verschijnselen 14-17. Genetische mutaties in OXPHOS componenten die ATP productie leidt afbreuk mitochondriale aandoeningen 17,18, die klinisch heterogene groep van aandoeningen met een prevalentie van ~ 1: 5000 individuen, en een van de meest voorkomende oorzaak van metabolic stoornissen bij kinderen en volwassenen. Deficit van mitochondriën afkomstig ATP invloed op meerdere orgaansystemen met een hoge energie-eisen organen, zoals de hersenen, het hart en de skeletspieren wordt voornamelijk beïnvloed bij deze patiënten 14,17,18. In de afgelopen jaren hebben meerdere studies bewijs geleverd voor mitochondriële disfunctie bij zowel neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen 15-17,19,20. Aangezien mitochondria essentieel en kritisch voor ontwikkeling van de hersenen en de functie, is het noodzakelijk om protocollen die veranderingen in de hersenen mitochondriale morfologie, structuur, grootte, aantal en distributie onder zowel gezonde als zieke toestanden kunnen analyseren ontwikkelen. Muismodellen mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit (GFP) werden geproduceerd om mitochondriale mutaties en lokalisatie visualiseren in de hersenen 21,22. Hoewel dit een zeer nuttig hulpmiddel mitochondriale motiliteit algemene verspreiding te onderzoeken, zijn er een aantal nadelen die include beperkte resolutie en gevoeligheid van fluorescentie microscopie. Deze kenmerken maken het moeilijk om de relatief kleine formaat mitochondria volgen. Evenzo seriële transmissie elektronenmicroscopie is met succes gebruikt om synaptische mitochondriën 23 bekijken, maar deze methode is zeer tijdrovend. Mitochondriale morfologie bekend is zeer dynamisch te zijn als ze worden voortdurend kernsplijting en kernfusie cycli, en in de meeste cellen mitochondria onderhouden van een sterk verbonden netwerk 24-26. Neuronen zijn sterk gepolariseerde cellen met meerdere dendrieten en axonen verlengd, en dat mitochondria een aangesloten netvormige netwerk in het cellichaam vormen kan hebben om te scheiden als zij hun weg door deze neurieten (figuur 1). Hierdoor hersenen mitochondriën zeer gevarieerd in grootte en vorm. Bijvoorbeeld met gebruikmaking serieblok-face scanning elektronenmicroscopie (SBFSEM) techniek we eerder waargenomen dat het verschil in de hoeveelheid of de grootte van extrasynaptic mitochondria aan mitochondria in de zenuwuiteinden kan zo veel als zestien vouwen 27.

Er zijn verschillende manieren voor het uitvoeren van analyses volume 28, welke seriële sectie TEM 29, geautomatiseerde tape verzamelen ultramicrotoom SEM 30 omvat, gefocusseerde ionenbundel SEM 31 en SBFSEM 32. De SBFSEM analyse heeft voordelen doordat zij de resolutie kwantitatieve gegevens over de morfologische vorm, grootte, verdeling en het aantal van organellen zoals mitochondriën, deze gebieden tot 1 mm van de hersenen. De technische werking is ook de minst veeleisende, met data-acquisitie en analyse binnen de mogelijkheden van vele biologische laboratoria die eerdere EM ervaring missen. De komst van commerciële instrumenten voor het genereren seriële sectie-achtige beelden heeft 3D ultrastructurele analyse van weefsels die routinematig techniek, die een onbevooroordeelde volumetrische analyse op een snelle en reproduceerbare wijze 28 verder toelaat </sup>. De SBFSEM werd eerst beschreven en gebruikt in het gebied van neurobiologie in 2004 32, gebaseerd op een idee van Leighton geïntroduceerd in 1981 33. Meerdere studies sindsdien deze techniek als een belangrijk instrument voor reconstructie analyse van neuronale circuits 34 zijn opgesteld. Bovendien vele kleinere projecten, biedt reconstructie analyse celorganellen 27,35-39 identificeren. Daar worden de verkregen beelden afkomstig zijn van lage spanning terug scatter elektronen, nieuwe kleuringsprotocollen waarin verschillende bekende heavy metal-kleuring technieken te combineren werden ontwikkeld om de resolutie van 40 te verhogen.

In dit artikel geven we een protocol voor het gebruik van 3D-elektronenmicroscopie beeldvorming en volumetrische analyse van de hersenen mitochondriën gebaseerd op methoden die eerder zijn gebruikt door ons en anderen 38,39,41. Het weefsel nabewerking methoden waren zoals eerder beschreven door Deerinck c.s.40.

Protocol

Ethiek Verklaring: Procedures waarbij proefdieren zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) op Virginia Tech. Let op: Extreme voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het hanteren en afvoeren verschillende onderdelen gebruikt in dit protocol. Voor gebruik moet de lokale institutionele richtlijnen en praktijken gezondheid en veiligheid worden opgesteld en in acht name van osmiumtetroxide dat vluchtig en zeer giftige, uranyl acetaat, die zowel een zwaar metaal en radioactieve bron en loodnitraa…

Representative Results

We tonen aan dat de hersenen mitochondriale morfologie en grootte heterogeen van verschillende neuronale deelcompartimenten. Confocale microscopie op lage dichtheid neuronale culturen getransduceerd met lentivirus uiten van mitochondriën gerichte groen fluorescerend eiwit toonde aan dat mitochondria die woonachtig zijn in neuronale soma vormen een reticulair netwerk, terwijl die woonachtig zijn in distale neurieten vertonen een discrete langwerpig morfologie (figuur 1 AB).</stro…

Discussion

De complexiteit van het zenuwstelsel moeilijk na te reconstrueren grote weefselvolumes en analyseren van de morfologie en de verdeling van organellen zoals mitochondriën met voldoende resolutie. Meerdere cellen waaronder neuronen, oligodendrocyten en astrocyten met talrijke processen verlengd driedimensionaal communiceren in het hersenweefsel 43. Omdat mitochondriën bevindt zowel in de soma van cellen en distale processen, mitochondriale morfologie uiterst pleomorf in het zenuwstelsel (figuur 1).</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Materials

C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson’s and Alzheimer’s disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd, V. A., Bohr, Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Brain MitochondriaSerial Block-face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial MorphologyNeurodegenerative DisordersNeurodevelopmental DisordersSample PreparationStainingDehydrationEmbedding
check_url/kr/54214?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image