ब्रेन माइटोकॉन्ड्रिया के विश्लेषण सीरियल ब्लॉक-फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग
Summary
Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Abstract
मानव मस्तिष्क एक उच्च ऊर्जा खपत अंग है कि मुख्य रूप से एक ईंधन के स्रोत के रूप में ग्लूकोज पर निर्भर करता है। ग्लूकोज ग्लाइकोलाइसिस, सप्ताह में तीन कार्बोक्जिलिक एसिड (टीसीए) चक्र और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण (OXPHOS) रास्ते के माध्यम से मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा catabolized है adenosine triphosphate (एटीपी) के रूप में सेलुलर ऊर्जा का उत्पादन करने के लिए। mitochondrial एटीपी उत्पादन की हानि mitochondrial रोग, जो प्रमुख तंत्रिका विज्ञान और myopathic लक्षणों के साथ चिकित्सकीय उपस्थित कारण बनता है। Mitochondrial दोष भी neurodevelopmental विकारों (जैसे आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार) और neurodegenerative विकारों में मौजूद हैं (जैसे पेशीशोषी पार्श्व काठिन्य, अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग)। इस प्रकार, वहाँ दोनों स्वस्थ और रोग राज्यों तहत mitochondrial आकृति विज्ञान, संरचना और वितरण के 3 डी विश्लेषण के प्रदर्शन के लिए क्षेत्र में एक वृद्धि की रुचि है। मस्तिष्क mitochondrial आकृति विज्ञान विशेष रूप से अत्यंत विविध है, कुछ माइटोकॉन्ड्रिया के साथ में उनsynaptic क्षेत्र <200 एनएम व्यास, जो पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी का संकल्प सीमा से नीचे है की रेंज में किया जा रहा है। मस्तिष्क में एक mitochondrially-लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त काफी confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा organellar का पता लगाने को बढ़ाता है। हालांकि, यह बड़े आकार के माइटोकॉन्ड्रिया की छवियों oversaturating बिना अपेक्षाकृत छोटे आकार के माइटोकॉन्ड्रिया का पता लगाने की संवेदनशीलता पर बाधाओं को दूर नहीं करता। जबकि धारावाहिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सफलतापूर्वक न्यूरोनल अन्तर्ग्रथन में माइटोकॉन्ड्रिया चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, इस तकनीक बहुत समय लेने वाली है, खासकर जब कई नमूने की तुलना है। सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SBFSEM) तकनीक सेक्शनिंग, ऊतक और डाटा अधिग्रहण की इमेजिंग ब्लॉक के एक स्वचालित प्रक्रिया शामिल है। यहाँ, हम कृंतक मस्तिष्क से एक निर्धारित क्षेत्र के SBFSEM प्रदर्शन करने के लिए तेजी से फिर से संगठित और mitochondrial आकृति विज्ञान कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस तकनीकnique भी एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र में mitochondrial संख्या, मात्रा, आकार और वितरण पर सटीक जानकारी प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि प्राप्त छवि संकल्प अधिक है (आम तौर पर 10 एनएम) के तहत किसी भी सकल mitochondrial रूपात्मक दोष भी पता लगाया जा सकता है।
Introduction
माइटोकॉन्ड्रिया गतिशील अंगों जो उनके आकार और सेलुलर संकेतों और जरूरतों के आधार पर स्थान बदलने के लिए, सेल cytoskeleton के साथ तंग बातचीत में हैं, और इस तरह के न्यूरॉन्स 1 में कैल्शियम धाराओं के रूप में सेलुलर घटनाओं की प्रतिक्रिया में। माइटोकॉन्ड्रिया भी अन्य सेलुलर अंगों के साथ जालिका, जो बदले में उनकी गतिशीलता और चयापचय 2 को नियंत्रित करता है जैसे बातचीत। Mitochondrial आकृति विज्ञान यानी विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में विविधता से पता चलता है। organelle के आकार कि चादरें, बोरे और अंडाकार 3 से मिलकर ट्यूबलर से भिन्न होता है। यह दिखाया गया है कि mitochondrial फ्यूजन और विखंडन चक्र प्रोटीन स्थान, आकार, आकृति और माइटोकॉन्ड्रिया 4 के वितरण को नियंत्रित कर सकते। इसके अलावा, mitochondrial आकार में परिवर्तन neurodegeneration, न्यूरोनल प्लास्टिसिटी, मांसपेशियों शोष, कैल्शियम संकेतन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों पीढ़ी के रूप में अच्छी तरह से उम्र और कोशिका मृत्यु फंसाने था के साथ जुड़े रहे हैंटी सेल विशिष्ट mitochondrial आकृति विज्ञान सामान्य सेलुलर समारोह 5-11 के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है।
माइटोकॉन्ड्रिया का एक प्रमुख bioenergetic समारोह चयापचय प्रतिक्रियाओं कि टीसीए चक्र के माध्यम से पोषक तत्वों की पूरी टूटने (यानी ग्लूकोज, फैटी एसिड या एमिनो एसिड) शामिल है और OXPHOS रास्ते 12 की एक श्रृंखला को क्रियान्वित करने से adenosine triphosphate (एटीपी) उत्पन्न करने के लिए है। मानव मस्तिष्क शरीर के वजन का केवल 2% हालांकि यह खपत ~ कुल ऊर्जा यह एक अत्यंत ऊर्जा अंग 13 की मांग कर रही है उत्पादन का 20% का गठन किया। इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि मानव में mitochondrial रोग मस्तिष्क संबंधी अभिव्यक्तियों 14-17 की एक बड़ी संख्या को जाता है। OXPHOS घटकों में जेनेटिक म्यूटेशन कि mitochondrial विकारों 17,18, जो ~ 1 की व्यापकता के साथ विकारों के नैदानिक विषम समूह रहे हैं करने के लिए ख़राब एटीपी पीढ़ी सुराग: 5,000 व्यक्तियों, और मीटर का सबसे आम कारण से एकबच्चों और वयस्कों में etabolic विकारों। माइटोकॉन्ड्रिया व्युत्पन्न एटीपी के घाटे में इस तरह के मस्तिष्क, हृदय और कंकाल की मांसपेशियों में मुख्य रूप से इन रोगियों 14,17,18 में प्रभावित किया जा रहा के रूप में उच्च ऊर्जा की मांग अंगों के साथ कई अंग प्रणालियों को प्रभावित करता है। हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों से दोनों neurodevelopmental और neurodegenerative विकारों 15-17,19,20 में mitochondrial रोग के लिए सबूत प्रदान की है। चूंकि माइटोकॉन्ड्रिया जरूरी है और मस्तिष्क के विकास और समारोह के लिए महत्वपूर्ण हैं, यह प्रोटोकॉल है कि दोनों स्वस्थ और रोगग्रस्त राज्यों तहत मस्तिष्क mitochondrial आकृति विज्ञान, संरचना, आकार, संख्या और वितरण में परिवर्तन का विश्लेषण कर सकते हैं विकसित करने के लिए आवश्यक है। Mitochondrially-लक्षित हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के साथ माउस मॉडल मस्तिष्क 21,22 में mitochondrial आंदोलनों और स्थानीयकरण कल्पना करने के लिए उत्पादन किया गया है। हालांकि इस mitochondrial गतिशीलता और सामान्य वितरण की जांच के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण है, वहाँ कुछ कमियां हैं जो समेतई सीमित संकल्प और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की संवेदनशीलता। इन विशेषताओं के लिए यह मुश्किल अपेक्षाकृत छोटे आकार के माइटोकॉन्ड्रिया ट्रैक करने के लिए बनाते हैं। इसी तरह, धारावाहिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सफलतापूर्वक synaptic माइटोकॉन्ड्रिया 23 देखने के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन इस विधि बहुत समय लगता है। Mitochondrial आकृति विज्ञान अत्यधिक गतिशील के रूप में वे निरंतर विखंडन और संलयन चक्र से गुजरना में जाना जाता है, और सबसे कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रिया एक अत्यधिक जुड़ा नेटवर्क 24-26 बनाए रखें। न्यूरॉन्स अत्यधिक ध्रुवीकरण कर रहे हैं कई dendrites और बढ़ाया एक्सोन, और माइटोकॉन्ड्रिया कि सेल शरीर में एक जुड़ा जालीदार नेटवर्क के रूप में के साथ कोशिकाओं को अलग करने के लिए के रूप में वे (चित्रा 1) इन neurites के माध्यम से अपना रास्ता बनाने के लिए हो सकता है। यह मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया आकार और आकार में अत्यंत विविध बनाता है। उदाहरण के लिए, सीरियल ब्लॉक चेहरे स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग (SBFSEM) तकनीक है, हम पहले से मनाया कि मात्रा या extrasynaptic mitochondr के आकार में अंतरआइए तंत्रिका टर्मिनलों में मौजूद माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में ज्यादा के रूप में सोलह 27 गुना हो सकता है।
मात्रा के प्रदर्शन के लिए कई दृष्टिकोण हैं विश्लेषण 28, जो धारावाहिक अनुभाग मंदिर 29, स्वचालित टेप ultramicrotome SEM 30 एकत्रित भी शामिल है, आयन बीम SEM 31, और 32 SBFSEM ध्यान केंद्रित किया। SBFSEM विश्लेषण इस तरह मस्तिष्क का 1 मिमी तक क्षेत्रों में माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में रूपात्मक आकृति, आकार, वितरण और अंगों की संख्या पर मात्रात्मक डेटा प्रदान करने के लिए संकल्प किया है कि उस में फायदे हैं। तकनीकी आपरेशन भी कम से कम मांग, कई जैविक प्रयोगशालाओं कि पिछले ईएम अनुभव की कमी की क्षमताओं के भीतर डाटा अधिग्रहण और विश्लेषण के साथ है। सीरियल अनुभाग की तरह छवियों पैदा करने के लिए वाणिज्यिक उपकरणों के आगमन के ऊतकों की 3 डी Ultrastructural विश्लेषण किया गया है एक नियमित तकनीक है, जो आगे एक तेजी से और repeatable ढंग से 28 में एक निष्पक्ष बड़ा विश्लेषण परमिट </sup>। SBFSEM पहली बार 2004 32 में वर्णित किया गया था और इस्तेमाल तंत्रिका जीव विज्ञान के क्षेत्र में, एक विचार 1981 33। कई अध्ययनों में लीटन द्वारा शुरू की तब से न्यूरोनल circuitry 34 के पुनर्निर्माण के विश्लेषण में एक प्रमुख साधन के रूप में इस तकनीक की स्थापना की है पर आधारित है। इसके अलावा, कई छोटे पैमाने पर परियोजनाओं के लिए, यह पुनर्निर्माण विश्लेषण सेलुलर organelles 27,35-39 की पहचान करने के लिए प्रदान करता है। चूंकि, अधिग्रहीत छवियों कम वोल्टेज वापस बिखराव इलेक्ट्रॉनों से निकाली गई है, नए धुंधला प्रोटोकॉल जो विभिन्न ज्ञात भारी धातु धुंधला तकनीक गठबंधन संकल्प 40 बढ़ाने के लिए विकसित किए गए।
इस पत्र में, हम 3 डी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग और तरीकों कि पहले हमें और दूसरों 38,39,41 द्वारा इस्तेमाल किया गया है के आधार पर मस्तिष्क माइटोकॉन्ड्रिया का बड़ा विश्लेषण के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। ऊतक बाद के प्रसंस्करण के तरीकों का इस्तेमाल किया, जैसा कि पहले Deerinck एट अल द्वारा वर्णित किया गया40।
Protocol
Representative Results
Discussion
तंत्रिका तंत्र की जटिलता ऐसे पर्याप्त संकल्प के साथ माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में बड़े ऊतक संस्करणों के पुनर्निर्माण और आकृति विज्ञान और अंगों के वितरण का विश्लेषण करने में एक महत्वपूर्ण चुनौती बन गया…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
| Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
| Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
| Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
| Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
| Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
| Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
| Tannic Acid | EMS | 21700 | |
| Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
| Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
| Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
| Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
| Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
| EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
| Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
| Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
| Ethanol | EMS | 15055 | |
| Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
| Embedding Mold | EMS | 70907 | |
| Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
| Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
| Razor | EMS | 72000 | |
| Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
| Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
| In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
| Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
| Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
| ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
| http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
| http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
| http://fiji.sc/TrakEM2 | |||
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