JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
신경과학

Analyse av Brain Mitokondrier Bruke Serial Block-Face Scanning elektronmikroskopi

Published: July 09, 2016
doi:
10.3791/54214
, , , , ,
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Summary

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Abstract

Hjernen er et kraftkrevende organ som i hovedsak baserer seg på glukose som en brennstoffkilde. Glukose blir katabolisert av hjerne mitokondriene via glykolyse, tri-karboksyl-syre (TCA) syklus og oksidativ fosforylering (OXPHOS) veier å produsere energi i cellene i form av adenosintrifosfat (ATP). Nedskrivning av mitokondriell ATP produksjon fører mitokondrie lidelser, som presenterer klinisk med fremtredende nevrologiske og myopatiske symptomer. Mitokondrie defekter er også til stede i nevrologiske lidelser (f.eks autisme spektrum lidelse) og nevrodegenerative lidelser (f.eks amyotrofisk lateral sklerose, Alzheimers og Parkinsons sykdom). Dermed er det en økt interesse for feltet for å utføre 3D analyser av mitokondriell morfologi, struktur og distribusjon under begge friske og sykdomstilstander. Hjernen mitokondrielle morfologi er meget mangfoldig, med noen mitokondrier særlig de iden synaptiske region er i området på <200 nm diameter, som er under oppløsningsgrensen av tradisjonell lysmikroskopi. Uttrykker en mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) i hjernen øker betydelig organellar påvisning av konfokal mikroskopi. Men det betyr ikke overvinne begrensninger på sensitiviteten for påvisning av relativt liten størrelse mitokondrier uten oversaturating bilder av store store mitokondriene. Mens seriell transmisjonselektronmikroskopi har blitt brukt for å karakter mitokondriene ved synapsen Denne teknikk er svært tidkrevende, spesielt når man sammenligner flere prøver. Serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknikken innebærer en automatisert prosess med seksjonering, bildeblokker vev og datainnsamling. Her gir vi en protokoll for å utføre SBFSEM av et definert område fra gnager hjernen til raskt rekonstruere og visualisere mitokondrie morfologi. dette technique kan også brukes til å gi nøyaktig informasjon om mitokondrie antall, volum, størrelse og fordeling i et definert område hjerne. Siden den oppnådde oppløsning er høy (vanligvis under 10 nm) eventuelle grove mitokondrielle morfologiske defekter kan også bli detektert.

Introduction

Mitokondriene er dynamiske organeller som endrer sin form og plassering, avhengig av cellulære signaler og behov, i tett interaksjon med celle cytoskjelett, og i respons til cellulære hendelser, for eksempel kalsiumstrømmer i nerveceller 1. Mitokondrier også samhandle med andre cellulære organeller f.eks endoplasmatiske retikulum, som igjen regulerer deres dynamikk og metabolisme 2. Mitokondrie morfologi viser heterogenitet i ulike celletyper ie. formen på organeller varierer fra røret til den består av plater, sekker og ovaler 3. Det har vist seg at mitokondrielle fusjons og fisjonssyklusproteiner kan regulere plassering, størrelse, form og fordeling av mitokondrier 4. Videre er endringene i form mitokondrienes assosiert med neurodegenerering, neuronal plastisitet, muskelatrofi, kalsiumsignalisering, reaktive oksygenarter generasjon, så vel som levetiden og celledød impliserer thaT-celle-spesifikke mitokondrielle morfologi er kritisk for å opprettholde normal cellefunksjon 5-11.

En stor bioenergetisk funksjon av mitokondriene er å generere adenosin trifosfat (ATP) ved å utføre en serie av metabolske reaksjoner som involverer fullstendig sammenbrudd av næringsstoffer (for eksempel glukose, fettsyrer eller aminosyrer) via TCA syklus og OXPHOS Pathways 12. Den menneskelige hjerne utgjør bare 2% av kroppsvekten, men den forbruker ~ 20% av den totale energi som produseres slik at det er en svært energikrevende organ 13. Det er derfor ikke overraskende at mitokondriell dysfunksjon hos mennesker fører til et stort antall av nevrologiske manifestasjoner 14-17. Genetiske mutasjoner i OXPHOS komponenter som svekker ATP generasjon fører til mitokondrie lidelser 17,18, som er klinisk heterogen gruppe lidelser med en forekomst på ~ 1: 5000 individer, og en av de vanligste årsaken til metabolic lidelser hos barn og voksne. Underskudd av mitokondrier-avledet ATP påvirker flere organsystemer med høy energikrevende organer som hjerne, hjerte og skjelettmuskulatur blir hovedsakelig påvirket hos disse pasientene 14,17,18. I de senere årene har flere studier gitt bevis for mitokondriell dysfunksjon i både nevrologiske og nevrodegenerative lidelser 15-17,19,20. Siden mitokondrier er viktig og avgjørende for hjernens utvikling og funksjon, er det viktig å utvikle protokoller som kan analysere endringer i hjernens mitokondrie morfologi, struktur, størrelse, antall og fordeling i henhold til både friske og syke tilstander. Musemodeller med mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein (GFP) har blitt produsert for å visualisere mitokondrielle bevegelser og lokalisering i hjernen 21,22. Selv om dette er et svært nyttig verktøy for å undersøke mitokondriebevegelighet og generell distribusjon, er det noen ulemper som inkluderer treninge begrenset oppløsning og følsomhet av fluorescens mikroskopi. Disse egenskapene gjør det vanskelig å spore de forholdsvis små størrelser mitokondriene. På samme måte har seriell transmisjonselektronmikroskopi blitt brukt til å vise synaptic mitokondriene 23, men denne fremgangsmåte er meget tidkrevende. Mitokondriell morfologi er kjent for å være svært dynamisk som de gjennomgår kontinuerlige fisjon og fusjon sykluser, og i de fleste cellene mitokondriene opprettholde et høyt tilkoblede nettverket 24-26. Nerveceller er sterkt polarisert celler med flere dendritter og utvidede axoner, og mitokondrier som danner en tilkoblet retikulære nettverk i cellen kroppen kan ha å skille som de gjør sin vei gjennom disse neurites (figur 1). Dette gjør hjerne mitokondrier ekstremt variert i størrelse og form. For eksempel, ved hjelp av serie blokk-ansikt scanning elektronmikroskopi (SBFSEM) teknikk, har vi tidligere observert at forskjellen i volumet eller størrelsen av extrasynaptic mitochondria til mitokondriene er tilstede i nerveterminaler kan være så mye som seksten fold 27.

Det finnes flere tilnærminger for å utføre volum analyser 28, som omfatter serie delen TEM 29, automatisert tape samle ultramicrotome SEM 30, fokusert ion stråle SEM 31, og SBFSEM 32. Den SBFSEM Analysen har fordeler ved at den har den oppløsning til å gi kvantitative data om den morfologiske form, størrelse, fordeling og antall av organeller som mitokondrier i områder inntil 1 mm av hjernen. Den teknisk drift er også den minst krevende, med datainnsamling og analyse innenfor mulighetene mange biologiske laboratorier som mangler forrige EM opplevelse. Ankomsten av kommersielle instrumenter for generering av serieseksjons-lignende bilder har gjort 3D ultrastructural analyse av vev en rutine teknikk, som ytterligere muliggjør en objektiv volumetrisk analyse i en hurtig og repeterbar måte 28 </sup>. Den SBFSEM ble først beskrevet og brukt innen nevrobiologi i 2004 32, basert på en idé introdusert av Leighton i 1981 33. Flere studier siden da har etablert denne teknikken som et viktig verktøy i rekonstruksjon analyse av nevronale kretser 34. Videre, for mange mindre prosjekter, gir det ombygging analyse for å identifisere cellulære organeller 27,35-39. Siden er de oppkjøpte bildene stammer fra lav spenning tilbake scatter elektroner ble nye flekker protokoller som kombinerer forskjellige kjente heavy metal fargeteknikker utviklet for å øke oppløsningen 40.

I denne artikkelen gir vi en protokoll for å utnytte 3D elektronmikroskopi bildebehandling og volumetrisk analyse av hjerne mitokondrier basert på metoder som tidligere har blitt brukt av oss og andre 38,39,41. De vev etterbehandlingsfremgangsmåter som ble brukt var som beskrevet tidligere av Deerinck m.fl.40.

Protocol

Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr fag har blitt godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Virginia Tech. Forsiktig: Extreme forholdsregler må tas når det gjelder fjerning av flere komponenter som brukes i denne protokollen. Før bruk må den lokale institusjons retningslinjer og helse- og sikkerhets praksis etableres og følges, spesielt for osmiumtetroksyd, som er flyktig og meget giftig, uranylacetat, som er både et tungt metall og kilde for radioaktivitet, og blynitrat, som er et tungmeta…

Representative Results

Vi viser at hjernen mitokondrie morfologi og størrelse er heterogen i forskjellige nevronale underrommene. Konfokalmikroskopi på lav tetthet nevronale kulturer transduced med lentivirus uttrykker mitochondrially målrettet grønt fluorescerende protein viste at mitokondriene bosatt i neuronal soma danne en retikulære nettverk, mens de som bor i distale neurites viser en diskret langstrakt morfologi (Figur 1 AB). Ved hjelp av SBFSEM teknikk, ble det mitokondrielle morf…

Discussion

Kompleksiteten av nervesystemet utgjør en betydelig utfordring i å rekonstruere store volumer vev og analysering av morfologien og fordelingen av organeller som mitokondrier med tilstrekkelig oppløsning. Flere celler, inkludert neuroner, oligodendrocytter og astrocytter med mange prosesser forlenget i tre dimensjoner samhandle innenfor hjernevevet 43. Siden mitokondriene ligger både i soma av celler og fjerne prosesser, er mitokondrie morfologi svært pleomorphic i nervesystemet (figur 1).</strong…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Materials

C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kasahara, A., Scorrano, L. Mitochondria: from cell death executioners to regulators of cell differentiation. Trends Cell Biol. 24, 761-770 (2014).
  2. Friedman, J. R., et al. ER tubules mark sites of mitochondrial division. Science. 334, 358-362 (2011).
  3. Bereiter-Hahn, J., Voth, M., Mai, S., Jendrach, M. Structural implications of mitochondrial dynamics. Biotechnol J. 3, 765-780 (2008).
  4. Campello, S., Scorrano, L. Mitochondrial shape changes: orchestrating cell pathophysiology. EMBO Rep. 11, 678-684 (2010).
  5. Trimmer, P. A., et al. Abnormal mitochondrial morphology in sporadic Parkinson’s and Alzheimer’s disease cybrid cell lines. Exp Neurol. 162, 37-50 (2000).
  6. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics–fusion, fission, movement, and mitophagy–in neurodegenerative diseases. Hum Mol Genet. 18, 169-176 (2009).
  7. Li, Z., Okamoto, K., Hayashi, Y., Sheng, M. The importance of dendritic mitochondria in the morphogenesis and plasticity of spines and synapses. Cell. 119, 873-887 (2004).
  8. Romanello, V., et al. Mitochondrial fission and remodelling contributes to muscle atrophy. EMBO J. 29, 1774-1785 (2010).
  9. Szabadkai, G., et al. Drp-1-dependent division of the mitochondrial network blocks intraorganellar Ca2+ waves and protects against Ca2+-mediated apoptosis. Mol Cell. 16, 59-68 (2004).
  10. Yu, T., Robotham, J. L., Yoon, Y. Increased production of reactive oxygen species in hyperglycemic conditions requires dynamic change of mitochondrial morphology. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 2653-2658 (2006).
  11. Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat Cell Biol. 9, 99-105 (2007).
  12. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M., 3rd, V. A., Bohr, Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25, 158-170 (2015).
  13. Macke, J. H., et al. Contour-propagation algorithms for semi-automated reconstruction of neural processes. J Neurosci Methods. 167, 349-357 (2008).
  14. Parikh, S. The neurologic manifestations of mitochondrial disease. Dev Disabil Res Rev. 16, 120-128 (2010).
  15. Frye, R. E., Rossignol, D. A. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms associated with autism spectrum disorders. Pediatr Res. 69, 41-47 (2011).
  16. Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1366, 211-223 (1998).
  17. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial disorders in the nervous system. Annu Rev Neurosci. 31, 91-123 (2008).
  18. DiMauro, S., Schon, E. A. Mitochondrial respiratory-chain diseases. N Engl J Med. 348, 2656-2668 (2003).
  19. Calkins, M. J., Manczak, M., Mao, P., Shirendeb, U., Reddy, P. H. Impaired mitochondrial biogenesis, defective axonal transport of mitochondria, abnormal mitochondrial dynamics and synaptic degeneration in a mouse model of Alzheimer’s disease. Hum Mol Genet. 20, 4515-4529 (2011).
  20. Anitha, A., et al. Downregulation of the expression of mitochondrial electron transport complex genes in autism brains. Brain Pathol. 23, 294-302 (2013).
  21. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Methods. 4, 559-561 (2007).
  22. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 10515-10520 (2015).
  23. Shepherd, G. M., Harris, K. M. Three-dimensional structure and composition of CA3→CA1 axons in rat hippocampal slices: implications for presynaptic connectivity and compartmentalization. J Neurosci. 18, 8300-8310 (1998).
  24. Wang, C., et al. Dynamic tubulation of mitochondria drives mitochondrial network formation. Cell Res. 25 (10), 1108-1120 (2015).
  25. Glancy, B., et al. Mitochondrial reticulum for cellular energy distribution in muscle. Nature. 523, 617-620 (2015).
  26. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics in mammals. Curr Top Dev Biol. 59, 119-144 (2004).
  27. Chavan, V., et al. Central presynaptic terminals are enriched in ATP but the majority lack mitochondria. PLoS One. 10, e0125185 (2015).
  28. Peddie, C. J., Collinson, L. M. Exploring the third dimension: volume electron microscopy comes of age. Micron. 61, 9-19 (2014).
  29. Harris, K. M., et al. Uniform serial sectioning for transmission electron microscopy. J Neurosci. 26, 12101-12103 (2006).
  30. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68 (2014).
  31. Bushby, A. J., et al. Imaging three-dimensional tissue architectures by focused ion beam scanning electron microscopy. Nat Protoc. 6, 845-858 (2011).
  32. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2, e329 (2004).
  33. Leighton, S. B. SEM images of block faces, cut by a miniature microtome within the SEM – a technical note. Scan Electron Microsc. , 73-76 (1981).
  34. Briggman, K. L., Denk, W. Towards neural circuit reconstruction with volume electron microscopy techniques. Curr Opin Neurobiol. 16, 562-570 (2006).
  35. Shomorony, A., et al. Combining quantitative 2D and 3D image analysis in the serial block face SEM: application to secretory organelles of pancreatic islet cells. J Microsc. 259, 155-164 (2015).
  36. Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J Mol Cell Cardiol. 76, 1-11 (2014).
  37. Miyazaki, N., Esaki, M., Ogura, T., Murata, K. Serial block-face scanning electron microscopy for three-dimensional analysis of morphological changes in mitochondria regulated by Cdc48p/p97 ATPase. J Struct Biol. 187, 187-193 (2014).
  38. Traka, M., et al. WDR81 is necessary for purkinje and photoreceptor cell survival. J Neurosci. 33, 6834-6844 (2013).
  39. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9953-9958 (2014).
  40. Deerinck, T. J., Bushong, E. A., Thor, A., Ellisman, M. H. . NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).
  41. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of Ranvier. J Neurosci. 31, 7249-7258 (2011).
  42. Hammer, S., Monavarfeshani, A., Lemon, T., Su, J., Fox, M. A. Multiple Retinal Axons Converge onto Relay Cells in the Adult Mouse Thalamus. Cell Rep. 12, 1575-1583 (2015).
  43. Kasthuri, N., et al. Saturated Reconstruction of a Volume of Neocortex. Cell. 162, 648-661 (2015).
  44. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nat Methods. 2, 920-931 (2005).
  45. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248, 73-76 (1990).
  46. Bohorquez, D., Haque, F., Medicetty, S., Liddle, R. A. Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell. J Vis Exp. , e52918 (2015).
  47. Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. J Microsc. 218, 52-61 (2005).
  48. Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7, e38011 (2012).
  49. Helmstaedter, M., Mitra, P. P. Computational methods and challenges for large-scale circuit mapping. Curr Opin Neurobiol. 22, 162-169 (2012).
  50. Helmstaedter, M., Briggman, K. L., Denk, W. High-accuracy neurite reconstruction for high-throughput neuroanatomy. Nat Neurosci. 14, 1081-1088 (2011).
  51. Saalfeld, S., Cardona, A., Hartenstein, V., Tomancak, P. CATMAID: collaborative annotation toolkit for massive amounts of image data. Bioinformatics. 25, 1984-1986 (2009).
  52. Giuly, R. J., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Method: automatic segmentation of mitochondria utilizing patch classification, contour pair classification, and automatically seeded level sets. BMC Bioinformatics. 13, 29 (2012).
  53. Jakobs, S., Wurm, C. A. Super-resolution microscopy of mitochondria. Curr Opin Chem Biol. 20, 9-15 (2014).

Tags

Brain MitochondriaSerial Block-face Scanning Electron MicroscopyMitochondrial MorphologyNeurodegenerative DisordersNeurodevelopmental DisordersSample PreparationStainingDehydrationEmbedding
check_url/kr/54214?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image