Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.
Mänskliga hjärnan är en energikrävande organ som huvudsakligen bygger på glukos som en energikälla. Glukos kataboliseras av hjärn mitokondrier via glykolysen tri-karboxylsyra (TCA) cykel och oxidativ fosforylering (OXPHOS) vägar för att producera cellulär energi i form av adenosintrifosfat (ATP). Nedskrivning av mitokondriella ATP produktionen orsakar mitokondriella sjukdomar, som uppvisar kliniskt med framstående neurologiska och myopatiska symptom. Mitokondriella defekter är också närvarande i nervsystemets sjukdomar (t.ex. autism) och neurodegenerativa sjukdomar (t.ex. amyotrofisk lateralskleros, Alzheimers och Parkinsons sjukdomar). Det finns således ett ökat intresse inom området för att utföra 3D analys av mitokondrie-morfologi, struktur och distribution under både friska och sjukdomstillstånd. Hjärnan mitokondriella morfologi är oerhört varierande, med några mitokondrier särskilt iden synaptiska området ligger i området av <200 nm i diameter, vilket är lägre än upplösningsgränsen av traditionell Ijusmikroskopi. Uttrycker en mitokondriellt riktade grönt fluorescerande protein (GFP) i hjärnan avsevärt förbättrar organeller upptäckt av konfokalmikroskopi. Men det inte övervinna de begränsningar på känsligheten för detektering av relativt liten storlek mitokondrier utan oversaturating bilder av stora och medelstora mitokondrier. Medan seriell transmissionselektronmikroskopi har med framgång använts för att karakterisera mitokondrier vid neuronala synapsen, är extremt tidskrävande, särskilt när man jämför flera prover denna teknik. Serieblock ansikte svepelektronmikroskop (SBFSEM) teknik innebär en automatiserad process för sektionering, bildbehandling block av vävnad och datainsamling. Här ger vi ett protokoll för att utföra SBFSEM av ett definierat område från gnagare hjärnan att snabbt rekonstruera och visualisera mitokondriella morfologi. denna technique kan också användas för att ge korrekt information om mitokondriell nummer, volym, storlek och fördelning i ett definierat område i hjärnan. Eftersom den erhållna bildupplösningen är hög (typiskt under 10 nm) eventuella grova mitokondriella morfologiska defekter kan också upptäckas.
Mitokondrier är dynamiska organ som ändrar sin form och placering beroende på de cellulära signaler och behov, i tät samverkan med cell cytoskelettet, och som svar på cellulära händelser såsom kalciumströmmar i nervceller 1. Mitokondrier också interagera med andra cellulära organeller t.ex. endoplasmatiska retiklet, vilket i sin tur reglerar deras dynamik och metabolism 2. Mitokondriell morfologi visar heterogenitet i olika celltyper dvs. formen av organell varierar från rund som består av lakan, säckar och ovaler 3. Det har visat sig att mitokondriella fusion och fission cykelproteiner kan reglera läge, storlek, form och fördelning av mitokondrier 4. Dessutom är förändringar i mitokondriell form i samband med neurodegeneration, neuronal plasticitet, muskelatrofi, kalciumsignalering, reaktiva syreradikaler generation samt livslängd och celldöd blandar thaT-cellspecifika mitokondriell morfologi är avgörande för att upprätthålla normal cellfunktion 5-11.
En stor bioenergetisk funktion av mitokondrier är att generera adenosintrifosfat (ATP) genom att exekvera en serie av metaboliska reaktioner som involverar fullständig nedbrytning av näringsämnen (dvs. glukos, fett-syror eller aminosyror) via TCA-cykeln och OXPHOS Pathways 12. Den mänskliga hjärnan utgör endast 2% av kroppsvikten men det förbrukar ~ 20% av den totala energi som produceras vilket gör det extremt energikrävande organ 13. Det är därför inte förvånande att mitokondriell dysfunktion hos människor leder till ett stort antal neurologiska manifestationer 14-17. Genetiska mutationer i OXPHOS komponenter som försämrar ATP generation leder till mitokondriella sjukdomar 17,18, som är kliniskt heterogen grupp av sjukdomar med en prevalens på ~ 1: 5000 personer, och en av de vanligaste orsaken till metabolic störningar hos barn och vuxna. Underskott på mitokondrierna härrörande ATP påverkar flera organsystem med hög energikrävande organ såsom hjärna, hjärta och skelettmuskler som främst berörs i dessa patienter 14,17,18. Under de senaste åren har flera studier visade för mitokondriell dysfunktion hos både nervsystemets och neurodegenerativa sjukdomar 15-17,19,20. Eftersom mitokondrierna är viktigt och avgörande för hjärnans utveckling och funktion, är det absolut nödvändigt att utveckla protokoll som kan analysera förändringar i hjärnans mitokondriell morfologi, struktur, storlek, antal och fördelning under både friska och sjuka tillstånd. Musmodeller med mitokondriellt riktade grönt fluorescerande protein (GFP) har tagits fram för att visualisera mitokondriella rörelser och lokalisering i hjärnan 21,22. Även om detta är ett mycket användbart verktyg för att undersöka mitokondriell rörlighet och allmän spridning, det finns vissa nackdelar som inkludee begränsad upplösning och känslighet fluorescensmikroskopi. Dessa attribut gör det svårt att spåra de relativt liten storlek mitokondrier. På liknande sätt har seriell transmissionselektronmikroskopi med framgång använts för att visa synaptisk mitokondrier 23, men denna metod är mycket tidskrävande. Mitochondrial morfologi är känd för att vara mycket dynamisk som de genomgår kontinuerliga klyvnings och fusionscykler, och i de flesta celler mitokondrier upprätthålla ett starkt sammanhängande nätverk 24-26. Nervceller är mycket polariserade celler med flera dendriter och utökade axoner, och mitokondrier som bildar en ansluten retikulära nätverket i cellkroppen kan behöva separera när de gör sig igenom dessa neuriter (Figur 1). Detta gör hjärnmitokondrier extremt varierande i storlek och form. Exempelvis med användning av serieblock-face svepelektronmikroskopi (SBFSEM) teknik, som tidigare observerade vi att skillnaden i volymen eller storleken av extrasynaptic mitochondrIA till mitokondrierna som finns i nervändarna kan vara så mycket som sexton vika 27.
Det finns flera metoder för att utföra volym analyser 28, som innefattar serie avsnitt TEM 29, automatiserad tejp samla ultramicrotome SEM 30, fokuserad jonstråle SEM 31 och SBFSEM 32. Den SBFSEM analys har fördelar i att den har upplösningen för att ge kvantitativa uppgifter om den morfologiska form, storlek, fördelning och antal organeller såsom mitokondrier i områden upp till 1 mm i hjärnan. Den tekniska driften är också minst krävande, med datainsamling och analys inom kapacitet många biologiska laboratorier som saknar tidigare EM erfarenhet. Tillkomsten av kommersiella instrument för att generera seriesektionsliknande bilder har gjort 3D ultra analys av vävnader en rutinteknik, vilket ytterligare tillåter en opartisk volymetriska analyser på ett snabbt och repeterbart sätt 28 </sup>. Den SBFSEM beskrevs först och används inom neurobiologi 2004 32, baserat på en idé som infördes genom Leighton i 1981 33. Flera studier har sedan dess etablerat denna teknik som ett viktigt verktyg i återuppbyggnaden analys av neuronala kretsar 34. Dessutom för många mindre projekt, ger det återuppbyggnads analys för att identifiera cellulära organeller 27,35-39. Eftersom de förvärvade bilderna härrör från lågspänning tillbaka scatter elektroner har nya färgningsprotokoll som kombinerar olika kända tungmetallfärgningstekniker utvecklats för att öka upplösningen 40.
I detta dokument ger vi ett protokoll för att utnyttja 3D-elektronmikroskopi avbildning och volymetriska analys av hjärn mitokondrier baserat på metoder som tidigare har använts av oss och andra 38,39,41. De vävnads post-bearbetningsmetoder som användes var såsom beskrivits tidigare av Deerinck et al40.
Komplexiteten av nervsystemet utgör en betydande utmaning i att rekonstruera stora vävnadsvolymer och analysera morfologin och distribution av organeller, såsom mitokondrier med tillräcklig upplösning. Flera celler inklusive neuroner, oligodendrocyter och astrocyter med många processer utökade i tre dimensioner samverkar inom hjärnvävnaden 43. Eftersom mitokondrierna ligger både i soma av celler och avlägsna processer, är mitokondriell morfologi extremt pleomorfa i nervsystemet (Figur 1).<…
The authors have nothing to disclose.
We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).
C57BL/6J mice | Jackson laboratory | 664 | |
Isoflurane | VETone, tradename Fluriso | 501017 | |
Dissection tray | Fisher scientific | S65105 | |
Dissection scissors | Ted Pella Inc. | 1316 | |
Butterfly canula | Exel International | 26704 | |
Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
Filter (0.45 micron) | EMD Millipore | NC0813356 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ61 | |
Vibratome sectioning system | Ted Pella Inc. | Vibratome 3000 | |
Sodium Cacodylate | EMS | 12300 | |
Tannic Acid | EMS | 21700 | |
Potassium Ferrocyanide | J.T. Baker | 14459-95-1 | |
Osmium Tetroxide 4% Solution | EMS | 19150 | |
Thiocarbohydrazide | EMS | 21900 | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A93100 | |
Potassium Hydroxide | Acros Organics | 43731000 | |
Lead Nitrate | EMS | 17900 | |
EMbed-812 EMBEDDING KIT | EMS | 14120 | Contains Embed 812 resin, DDSA, NMA, and DMP-30. |
Glutaraldehyde 25% EM Grade | Polysciences Inc. | 1909 | |
Paraformaldehyde | EMS | 19202 | |
Uranyl Acetate | EMS | 22400 | |
Ethanol | EMS | 15055 | |
Propylene Oxide | EMS | 20400 | |
Embedding Mold | EMS | 70907 | |
Aluminum specimen pin | EMS | 70446 | |
Colloidal Silver Liquid | EMS | 12630 | |
Razor | EMS | 72000 | |
Super Glue (Loctite Gel Control) | Loctite | 234790 | Hardware/craft stores carry this item |
Conductive epoxy | Ted Pella Inc. | 16043 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Sigma VP | |
In chamber ultramicrotome for SEM | Gatan Inc. | 3View2 | Can be designed for other SEMs |
Trimming microscope for pin preparation | Gatan Inc. | supplied as part of 3View system | |
Low kV backscattered electron detector | Gatan Inc. | 3V-BSED | |
ImageJ/ Fiji processing package | ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 | http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf | |
http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |||
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf | |||
http://fiji.sc/TrakEM2 |