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신경과학

シリアルブロック・フェイス走査型電子顕微鏡を用いて脳ミトコンドリアの解析

Published: July 09, 2016
doi:
10.3791/54214
, , , , ,
1Virginia Tech Carilion Research Institute, 2Renovo Neural Incorporated

Summary

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Abstract

人間の脳は、主燃料源として、グルコースに依存している臓器を消費する高エネルギーです。グルコースは、アデノシン三リン酸（ATP）の形態の細胞エネルギーを産生するために、解糖、トリカルボン酸（TCA）サイクル及び酸化的リン酸化（OXPHOS）経路を介して脳ミトコンドリアによって異化されます。ミトコンドリアのATP産生の障害は、顕著な神経学的および筋疾患の症状を臨床的に提示するミトコンドリア障害を引き起こします。ミトコンドリアの欠陥はまた、神経発達障害（ 例えば 、自閉症スペクトラム障害）および神経変性疾患に存在している（ 例えば 、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病およびパーキンソン病）。このように、健康と病気の両方の状態の下でミトコンドリアの形態、構造と分布の3次元解析を行うためのフィールドへの関心の高まりがあります。脳ミトコンドリアの形態は、特にいくつかのミトコンドリアで、中のものは極めて多様ですシナプス領域は、従来の光学顕微鏡の解像限界以下である<200 nmの直径の範囲にあります。脳内のミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現することは著しく、共焦点顕微鏡によるオルガネラの検出を強化します。しかし、大型ミトコンドリアの画像を過飽和することなく、比較的小サイズのミトコンドリアの検出感度の制約を克服していません。シリアル透過電子顕微鏡が正常神経シナプスにおいてミトコンドリアを特徴付けるために使用されてきたが、この技術は非常に時間のかかる複数のサンプルを比較する場合は特にです。シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBFSEM）技術、組織、およびデータ収集の撮像ブロックを切片の自動化プロセスを含みます。ここでは、急速にミトコンドリアの形態を再構築し、視覚化するげっ歯類の脳から定義された領域のSBFSEMを実行するためのプロトコルを提供します。このハイテクniqueはまた、定義された脳領域におけるミトコンドリアの数、量、サイズおよび分布に関する正確な情報を提供するために使用することができます。得られた画像の解像度は、（典型的には10nm未満）高いため、任意の総ミトコンドリアの形態学的欠陥も検出することができます。

Introduction

ミトコンドリアは細胞骨格との緊密な相互作用において、そのようなニューロン1におけるカルシウム電流などの細胞事象に応答して、携帯手がかりやニーズに応じて、その形状と位置を変更する動的な細胞小器官です。ミトコンドリアはまた、他の細胞小器官と相互作用順番に彼らのダイナミクスと代謝2を調節する小胞体を、 例えば 。ミトコンドリアの形態、 すなわち異なる細胞型における不均一性を示しています。細胞小器官の形状は、筒状のシート、袋や楕円3からなるものに変化します。ミトコンドリアの融合および分裂周期タンパク質は、ミトコンドリア4の位置、大きさ、形状及び分布を調節することができることが示されています。また、ミトコンドリアの形状の変化は、神経変性、神経可塑性、筋萎縮、カルシウムシグナル伝達、活性酸素種の生成だけでなく、寿命及び細胞死関与股関節に関連していますT細胞特異的なミトコンドリアの形態は、正常な細胞機能5-11の維持に重要です。

ミトコンドリアの主要な生体エネルギー機能は、TCAサイクルを介して、完全な栄養素の破壊（ すなわち 、グルコース、脂肪酸、酸またはアミノ酸）を含んでおり、OXPHOSが12を経路代謝反応のシリーズを実行することにより、アデノシン三リン酸（ATP）を生成することです。人間の脳は、体重のわずか2％しかし、それは〜それを器官13を要求する非常にエネルギーを作る製造全エネルギーの20％を消費する構成します。ヒトにおけるミトコンドリア機能障害は、神経学的症状14-17の多くをもたらすことは驚くべきことではありません。 5000個人、およびmの最も一般的な原因の1：ATP生成を損なうOXPHOSコンポーネントの遺伝的変異は、臨床的に不均質な〜1の有病率と疾患群であるミトコンドリア病17,18につながり、子供と大人でetabolic障害。ミトコンドリア由来のATPの赤字は、脳、心臓および骨格筋は、主にこれらの患者14,17,18に影響されるような高エネルギー厳しい臓器で複数の器官系に影響を与えます。近年では、複数の研究では、神経発達と神経変性疾患15-17,19,20両方におけるミトコンドリア機能障害のための証拠を提供しました。ミトコンドリアが不可欠と脳の発達と機能に重要であるので、健康と病気の両方の状態の下で脳ミトコンドリアの形態、構造、大きさ、数および分布の変化を分析することができるプロトコルを開発することが不可欠です。ミトコンドリア標的化緑色蛍光タンパク質（GFP）を有するマウスモデルは、脳21,22ミトコンドリア運動および局在化を可視化するために製造されています。これはミトコンドリアの運動性と一般的な分布を調べるために非常に便利なツールですが、INCLUDいくつかの欠点があります電子限られた解像度および蛍光顕微鏡の感度。これらの属性は、それが困難な比較的小さなサイズのミトコンドリアを追跡することを可能にします。同様に、シリアル伝送電子顕微鏡が正常シナプスミトコンドリア23を表示するために使用されてきたが、この方法は非常に時間がかかります。ミトコンドリアの形態は、それらが連続的な分裂および融合サイクルを受けるように非常に動的であることが知られており、大部分の細胞においてミトコンドリアは非常に接続されたネットワーク24〜26に維持されます。ニューロンは、複数の樹状突起と拡張軸索と高度に極性細胞であり、細胞体で接続された網状ネットワークを形成するミトコンドリアは、彼らがこれらの神経突起を介して自分の道（ 図1）を作るように分離する必要があります。これは、大きさや形状が極めて多様な脳ミトコンドリアを作ります。例えば、シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡を用いて（SBFSEM）技術は、我々が以前に観察されたシナプスmitochondrの体積またはサイズの違いとりわけ神経終末に存在するミトコンドリアに限り16として倍の27とすることができます。

ボリュームを実施するためのいくつかのアプローチがありますウルトラSEM 30収集シリアルセクションのTEM 29、自動化されたテープを含む、28の分析は、イオンビームSEM 31、およびSBFSEM 32を集中しました。 SBFSEM分析は、脳、1ミリメートルまでの領域におけるミトコンドリアのように、それは形態学的形状、大きさ、分布、および細胞小器官の数の定量的データを提供するために解像度を有するという利点を有します。技術的な操作は、以前のEMの経験が不足している多くの生物学的研究室の能力の範囲内のデータ収集と分析しても、少なくとも厳しいです。連続切片のような画像を生成するための市販の装置の出現は、組織の3次元超微細構造解析を行っている、さらに迅速かつ繰り返し可能な方法28で公平な容積測定分析を可能にするルーチン技術、 </SUP>。 SBFSEMは、最初1981年33でレイトンによって導入されたアイデアをもとに、2004年32に記載されており、神経生物学の分野で使用された。それ以来、複数の研究は、神経回路34の再建分析の主要なツールとして、この技術を確立しました。また、多くの小規模なプロジェクトのために、それは、細胞小器官27,35-39を識別するために、再構成分析を提供します。以降、取得された画像は、低電圧後方散乱電子から誘導され、別の既知の重金属染色技術を組み合わせた新たな染色プロトコルは、解像度40を増加させるために開発されました。

本稿では、3次元電子顕微鏡イメージング、以前に私たちと他の人38,39,41によって使用されている方法に基づいて脳ミトコンドリアの容量分析を利用するためのプロトコルを提供します。組織後処理方法として以前Deerinck らによって記載された使用40。

Protocol

倫理文：動物を対象とする手順は、バージニア工科大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されています。 注意：このプロトコルで使用されるいくつかのコンポーネントを処理し、廃棄する際エクストリーム予防措置を講じなければなりません。使用前に、地元の施設の指針と健康と安全慣行を確立し、従わなければならない、特に揮発性および非常に有毒である四酸化オスミウム、た…

Representative Results

我々は、脳ミトコンドリアの形態と大きさが異なるニューロンのサブコンパートメントにおいて不均一であることを示しています。ミトコンドリアを標的と緑色蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスで形質導入された低密度の神経細胞培養上の共焦点顕微鏡は、遠位神経突起に存在するものは個別の細長い形態（ 図1 AB）を示すのに対し、神経細胞の…

Discussion

神経系の複雑さは、大きな組織のボリュームを再構築し、そのような十分な解像度を持つミトコンドリアなどの細胞小器官の形態や分布の分析に重要な課題を提起します。 3次元に拡張する多数のプロセスとニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを含む複数の細胞が脳組織43内で相互作用します。ミトコンドリアは細胞や遠くの過程の細胞体の両方に存在するので?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Sidney Walker for providing technical help. This work was supported in part by a grant from the National Institute of Health (1R01EY024712-01A1).

Materials

C57BL/6J mice Jackson laboratory  664
Isoflurane VETone, tradename Fluriso 501017
Dissection tray Fisher scientific  S65105 
Dissection scissors Ted Pella Inc. 1316
Butterfly canula Exel International 26704
Phosphate buffer saline Sigma-Aldrich P4417-100TAB
Filter (0.45 micron) EMD Millipore NC0813356
Dissection microscope Olympus SZ61
Vibratome sectioning system Ted Pella Inc. Vibratome 3000
Sodium Cacodylate EMS 12300
Tannic Acid EMS 21700
Potassium Ferrocyanide J.T. Baker 14459-95-1
Osmium Tetroxide 4% Solution EMS 19150
Thiocarbohydrazide EMS 21900
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A93100
Potassium Hydroxide Acros Organics 43731000
Lead Nitrate EMS 17900
EMbed-812 EMBEDDING KIT EMS 14120 Contains Embed 812  resin, DDSA, NMA, and DMP-30.
Glutaraldehyde 25% EM Grade Polysciences Inc. 1909
Paraformaldehyde EMS 19202
Uranyl Acetate EMS 22400
Ethanol EMS 15055
Propylene Oxide EMS 20400
Embedding Mold EMS 70907
Aluminum specimen pin EMS 70446
Colloidal Silver Liquid EMS 12630
Razor EMS 72000
Super Glue (Loctite Gel Control) Loctite 234790 Hardware/craft stores carry this item
Conductive epoxy Ted Pella Inc. 16043
Scanning electron microscope Zeiss Sigma VP
In chamber ultramicrotome for SEM Gatan Inc. 3View2 Can be designed for other SEMs
Trimming microscope for pin preparation Gatan Inc. supplied as part of 3View system
Low kV backscattered electron detector Gatan Inc. 3V-BSED
ImageJ/ Fiji processing package  ImageJ ver 1.50b, FIJI download Oct 1, 2015 http://zoi.utia.cas.cz/files/imagej_api.pdf
http://rsb.info.nih.gov/ij/
http://www.icmr.ucsb.edu/programs/3DWorkshop/Uchic-2015_FIJI_Tutorial.pdf
http://fiji.sc/TrakEM2
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Mukherjee, K., Clark, H. R., Chavan, V., Benson, E. K., Kidd, G. J., Srivastava, S. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (113), e54214, doi:10.3791/54214 (2016).
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