To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
हिप्पोकैम्पस पर निर्भर स्पष्ट स्मृति (तथ्यों और घटनाओं के लिए स्मृति) में गिरावट अल्जाइमर रोग (ई) की जल्द से जल्द नैदानिक लक्षण में से एक है। यह अच्छी तरह से स्थापित है कि अन्तर्ग्रथन घटाने और आगामी neurodegeneration ईस्वी में स्मृति दोष के लिए सबसे अच्छा predictors हैं। नवीनतम अध्ययन घुलनशील amyloid बीटा oligomers (Aβo) है कि लगभग 10 से 15 वर्ष करने के लिए मानव मस्तिष्क में जमा करने से पहले नैदानिक लक्षण स्पष्ट हो शुरू की न्यूरोटोक्सिक भूमिका पर बल दिया है। कई रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि घुलनशील Aβo ई मॉडल और मनुष्यों में स्मृति घाटे के साथ सहसंबंधी। Aβo प्रेरित neurodegeneration न्यूरोनल और मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृतियों में मनाया अधिक कई पशु मॉडल में पुन: पेश करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है। यहाँ दिखाया दोहराया Aβo सुई लेनी के मॉडल को इस मुद्दे पर काबू पाने और नई बीमारी को संशोधित करने के उपचारों के विकास के लिए दो प्रमुख डोमेन को संबोधित अनुमति: जैविक मार्कर की पहचान जल्दी ई निदान करने के लिए, और आणविक व्यवस्था का निर्धारणnisms ईस्वी की शुरुआत में Aβo प्रेरित स्मृति घाटे underpinning। घुलनशील Aβo कुल अपेक्षाकृत तेजी में अघुलनशील Aβ तंतुओं है कि रोगियों के नैदानिक राज्य के साथ खराब सहसंबंधी के बाद से, घुलनशील Aβo हौसले से तैयार और हिप्पोकैम्पस में उल्लेखनीय कोशिका मृत्यु का उत्पादन करने के लिए छह दिनों के दौरान एक बार प्रति दिन इंजेक्ट किया जाता है। हम प्रवेशनी इस्तेमाल किया विशेष Aβo के एक साथ सुई लेनी और हिप्पोकैम्पस आसमाटिक पंप का प्रयोग करने में Aβo एंटीबॉडी (6E10) की सतत प्रेरणा के लिए डिजाइन। इस विवो विधि में अभिनव अब नया विज्ञापन चिकित्सा कि पूर्व मनोभ्रंश रोगियों में बयान और Aβo की न्यूरोटॉक्सिटी को रोकने सकता है की दक्षता को मान्य करने के preclinical अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है।
यह शुरू में प्रस्तावित किया गया था मस्तिष्क में अघुलनशील Aβ प्रजातियों की कि संचय ई रोगजनन के लिए केंद्रीय था। 1,2 हालांकि, सजीले टुकड़े भी कुछ संज्ञानात्मक सामान्य बुजुर्ग में पता चला रहे हैं। 3-7 सहसंबंध गरीब पट्टिका बयानों और संज्ञानात्मक घाटे के बीच मौजूदा काबू पाने के लिए विज्ञापन में, नवीनतम रिपोर्ट रोग है, जो ज्यादा रोगियों के नैदानिक राज्य के साथ बेहतर है। 8-14 Aβ oligomerization की प्रक्रिया के बाद से सहसंबंधी की शुरुआत में विषाक्त घुलनशील Aβo की मौजूदगी से पता चला है बहुत गतिशील है, यह सुझाव दिया था कि न्यूरोटॉक्सिटी oligomer का केवल एक विशिष्ट प्रकार के बजाय विभिन्न Aβo से प्रेरित है। 14-16 के बाद से कई अध्ययनों से पता चला है कि Aβo अन्तर्ग्रथन और neuronal नुकसान करने से पहले अन्तर्ग्रथन रोग आरंभ कर सकते हैं, 17-24 मौजूदा सिद्धांतों से संकेत मिलता है कि Aβ संबंधी उपचार में कारगर हो सकता है बल्कि बाद के चरणों की तुलना में जल्दी ई के रूप में क्लिनिकल परीक्षण में अब तक का परीक्षण किया।
ई रोगजनन में से एक बानगी सुविधा विशाल और व्यापक सेल रोग की देर चरणों में मनाया मौत, और महत्वपूर्ण अन्तर्ग्रथन और neuronal नुकसान स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्रों में मनाया जब स्मृति घाटे नैदानिक स्तर पर पहचाने जाने जाते हैं। पर्फोरेंट मार्ग है कि entorhinal प्रांतस्था (ईसी) दांतेदार गाइरस के लिए (डीजी) से परियोजनाओं ईस्वी के prodromal राज्य के दौरान विज्ञापन के प्रारंभिक शुरुआत में स्पष्ट रूप से परेशान है। 25,26 जब हल्के संज्ञानात्मक हानि (एमसीआई) स्पष्ट महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु हो जाता है डीजी में synaptic नुकसान के साथ ही चुनाव आयोग में पता चला है। 25,26
हालांकि सबूत का एक बड़ा शरीर जल्दी ईस्वी में घुलनशील Aβo के जहरीले कार्रवाई केंद्रित किया है, 8-14 Aβo प्रेरित neurodegeneration न्यूरोनल संस्कृति या organotypic मस्तिष्क टुकड़ा संस्कृति में मनाया अधिक पशु मॉडल में पुन: पेश करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो गया है। 27 ट्रांसजेनिक विज्ञापन का सबसे मॉडल एक overexpressingβ सजीले टुकड़े, ताऊ hyperphosphorylation, synaptic की कमी और स्मृति घाटे की है। 27 हालांकि, इन मॉडलों के विज्ञापन रोगियों के हिप्पोकैम्पस में मनाया मॉडलिंग कोशिका मृत्यु में बहुत कम सफल रहे हैं। इन तकनीकी मुद्दों पर काबू पाने के लिए हम घुलनशील Aβo की इन्ट्रासेरेब्रल सुई लेनी के आधार पर एक मॉडल विकसित किया है। हम पहले यहाँ दोहराया है कि घुलनशील Aβo के हिप्पोकैम्पस लेनी क्रमिक न्यूरोनल हानि और ताऊ hyperphosphorylation, दो रोग ईस्वी में स्मृति गिरावट के साथ जुड़े पहचान के लिए प्रेरित सूचना दी। 28, हम प्रवेशनी का उपयोग करके विज्ञापन के उपचारों का परीक्षण करने के लिए एक उपन्यास विधि दिखा रहे हैं विशेष रूप से Aβo के एक साथ सुई लेनी के लिए डिजाइन और Aβo एंटीबॉडी (6E10) आसमाटिक पंपों के साथ की सतत प्रेरणा।
आसमाटिक पंप सीधे Aβo के अर्क स्थल पर Aβo प्रेरित neurodegeneration के खिलाफ किसी भी एंटीबॉडी (या अन्य यौगिकों) की दक्षता विवो में परीक्षण करने के लिए एक अनोखा तरीका प्रदान करते हैं। इस प्रकार, इन पंपों रेपरएक ठोस सबूत की अवधारणा ईस्वी में संभावित चिकित्सीय एजेंट की कार्रवाई के तंत्र के बारे में स्थापित करने के लिए एक सुविधाजनक उपकरण ESENT। चूंकि हाल की रिपोर्ट ईस्वी के प्रारंभिक दौर में घुलनशील Aβo का महत्वपूर्ण प्रभाव का कहना है, कई Aβo की ओर निर्देशित उपचार वास्तव में शैक्षिक और दवा प्रयोगशालाओं द्वारा जांच की जा रही है। इस उपन्यास पशु मॉडल synaptic और neuronal नुकसान जल्दी ईस्वी में मनाया नकल उतार अनुमति देता है, और आसमाटिक पंप लगातार Aβo अर्क स्थल पर विशेष उपचार एजेंटों तर करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हल्के में पिछले कुछ वर्षों से अधिक का परीक्षण मरीजों को उदार करने के लिए प्रेरित शोधकर्ताओं पूर्व मनोभ्रंश रोगियों में परीक्षण आरंभ करने के लिए के रूप में प्राधिकृत चिकित्सा के दोहराव विफलताओं से पहले Aβo बहुतायत से जमा और अपरिवर्तनीय मस्तिष्क क्षति उत्पन्न करने के लिए शुरू करते हैं। इस संदर्भ में, नए यौगिकों कि बयान और फलस्वरूप Aβo की न्यूरोटॉक्सिटी रोकने का परीक्षण पूर्व नैदानिक रोगियों के हित में हो सकता है।
इस प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम है कि विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है। जब प्रवेशनी दाखिल, दंत सीमेंट जब यह दूसरी प्रवेशनी के छेद अवरुद्ध को रोकने के लिए भी तरल है लगाने से बचें। यह P50 पंप से जुड़ी कैथेटर के मुक्त अंत में दंत सीमेंट जगह करने की जलन और एक संभव भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। stereotaxic सर्जरी के दिन, डमी प्रवेशनी कि गाइड प्रवेशनी के रूप में एक ही लंबाई का उपयोग प्रवेशनी अवरुद्ध से बचने के लिए। हालांकि, स्थापित करने के बाद पंप कम डमी प्रवेशनी कि बंद से पहले प्रवेशनी के कोण हाथ हिप्पोकैम्पस के लिए पंप से समाधान का उचित जान फूंकना अनुमति देने के लिए उपयोग करें। बारीकी से Aβo लेनी मॉनिटर और सत्यापित करें कि हवा कैथेटर में किया बुलबुला सुई लेनी के दौरान लगातार बढ़ रहा है। हमेशा यकीन है कि इंजेक्शन लगाने प्रवेशनी पूरी तरह से लेनी दौरान गाइड प्रवेशनी में डाला जाता है।
यदि समस्या Aβ निषेचन के दौरान मुठभेड़ हैसत्यापित करें कि आंतरिक प्रवेशनी अवरुद्ध नहीं है। यदि यह मामला है, आंतरिक प्रवेशनी के माध्यम से बाँझ आसुत जल फ्लश। गाइड प्रवेशनी बाधित है, तो गाइड प्रवेशनी में आंतरिक प्रवेशनी की बारी है। अन्यथा आंतरिक प्रवेशनी ऊपर और नीचे ले जाएँ। टेकना में विवाद चूहों के लिए तनावपूर्ण हो सकता है, विशेष रूप से पहले दिन। पशु के तनाव को कम करने के लिए, हम में हेरफेर और stereotaxic सर्जरी से पहले टेकना चूहों अभ्यस्त करने के लिए सलाह देते हैं।
कई फायदे इस उपन्यास के लिए जिम्मेदार ठहराया और इन विवो दृष्टिकोण में लचीला हो सकता है। दरअसल, Aβo की प्रकृति सही अर्क से पहले नियंत्रण किया जा सकता इंजेक्शन, और Aβ तैयारियों के विभिन्न प्रकार (उदाहरण के सिंथेटिक बनाम मस्तिष्क व्युत्पन्न Aβ समाधान के लिए) विवो में उनकी न्यूरोटॉक्सिटी मूल्यांकन करने के लिए इंजेक्शन जा सकता है। यह मॉडल भी तंत्र है जिसके द्वारा विभिन्न Aβ प्रजातियों (जैसे, monomers, निम्न और उच्च आणविक वजन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता राजभाषाigomers, protofibrils) विवो में neurotoxic प्रभाव पैदा कर सकते हैं, और कैसे प्रतिरक्षा चिकित्सा उपचार की तरह दिमाग में उनकी हानिकारक प्रभाव प्रतिक्रिया हो सकती है। चूंकि लेनी जाग, स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में प्रदर्शन कर रहे हैं, वहाँ संवेदनाहारी एजेंटों और संकेत दे रास्ते पर Aβo समाधान के बीच कोई confounding प्रभाव, के रूप में पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है स्वतंत्र रूप से पशुओं के बढ़ने में 32,33 आधान कर रहे हैं भी व्यवहार परीक्षण के साथ संगत कर रहे हैं। किसी भी समय से पहले और सुई लेनी के बाद।
Aβo और पंप स्थापना की सुई लेनी अलग अलग उम्र के जानवर में किया जा सकता है उम्र बढ़ने के दौरान Aβo के प्रभाव और उपचार का निर्धारण। चूंकि neurodegeneration अर्क साइट के आसपास के क्षेत्र में होता है अन्तर्ग्रथन और neuronal नुकसान अलग और स्थानीय मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रेरित किया जा सकता है। Aβo की जमानत के अर्क और नियंत्रण (वाहन या हाथापाई Aβ) एक ही पशु के भीतर किसी भी बदलाव के लिए नियंत्रित करने की अनुमति देता है। इसके विपरीत, Aβo या नियंत्रण पसंस्थानों सही में द्विपक्षीय इंजेक्शन और हिप्पोकैम्पस छोड़ दिया है, उदाहरण के लिए व्यवहार कार्य में पशुओं का परीक्षण जब जा सकता है। Aβo और उपचार का आसव एक साथ किया जा सकता है या वैकल्पिक रूप से पंप अगर इलाज Aβ बयान के बाद प्रभावी है मूल्यांकन करने के लिए Aβo निषेचन के बाद से स्थापित किया जा सकता है। जब Aβo की Intracerebroventricular लेनी कर रही है यहाँ वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। intracellular संकेत दे रास्ते पर Aβo के प्रभाव से पहले और एक हद तक कम समय सीमा के भीतर neuronal नुकसान के बाद का मूल्यांकन किया जा सकता है। खुराक और Aβ सुई लेनी की संख्या भी एक कम या ज्यादा गंभीर Aβ pathogenicity प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
हालांकि बहुत बहुमुखी, इस तकनीक कुछ सीमाएँ हैं। प्रवेशनी आरोपण सर्जरी के बाद ऊतक और पहले कुछ दिनों में neuroinflammation के एक यांत्रिक व्यवधान पैदा करता है। इस प्रकार, यह Aβo infu शुरू करने से पहले सर्जरी के बाद कम से कम एक सप्ताह तक प्रतीक्षा करने के लिए आवश्यक हैसायन, और उचित नियंत्रण (वाहन या निष्क्रिय हाथापाई Aβ के इंजेक्शन) इन घटनाओं को ध्यान में रखना जोड़ने के लिए। इसके अलावा, केवल Aβo की एक छोटी मात्रा समाधान के प्रसार को सीमित करने का संचार किया जा सकता है।
आसमाटिक पंप Aβ प्रेरित neurodegeneration रोकने के लिए बनाया एजेंटों की preclinical सत्यापन के लिए एक सुविधाजनक और अद्वितीय वितरण पद्धति प्रतिनिधित्व करते हैं। चूंकि 6E10 एंटीबॉडी के साथ प्रतिरक्षा इससे पहले, मस्तिष्क में Aβ संचय को कम करने के लिए 31 दिखाया गया है कि हम अपने नए विवो दृष्टिकोण को मान्य करने के लिए एक सबूत की अवधारणा के रूप में 6E10 एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया। इस मॉडल में आसमाटिक पंप का इस्तेमाल अब उपन्यास रोग को संशोधित चिकित्सा कि पूर्व नैदानिक ई रोगियों में बयान और Aβo की न्यूरोटॉक्सिटी को रोकने सकता है विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |