To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Nedgang i hippocampus-avhengig eksplisitt hukommelse (minne for fakta og hendelser) er en av de tidligste kliniske symptom på Alzheimers sykdom (AD). Det er godt etablert at synapse tap og påfølgende nevrodegenerasjon er de beste prediktorer for hukommelse svekkelser i AD. Seneste undersøkelser har understreket nevrotoksisk rolle av oppløselige amyloid-beta oligomerer (Aβo) som begynner å hope seg opp i den menneskelige hjerne omtrent 10 til 15 år før de kliniske symptomer blir tydelige. Mange rapporter tyder på at løselig Aβo korrelerer med hukommelsessvikt i AD modeller og mennesker. Den Aβo-indusert nevrodegenerasjon observert i nevrale og hjernen skive kulturer har vært mer utfordrende å reprodusere i mange dyremodeller. Modellen av gjentatte Aβo infusjoner vises her overvinne dette problemet og la adressering to viktige domener for utvikling av nye sykdomsmodifiserende behandling: identifisere biologiske markører for å diagnostisere tidlig AD, og bestemme molekyl mechamekanismer underbygger Aβo-indusert hukommelsessvikt ved utbruddet av AD. Siden løselig Aβo samlet relativt raskt inn i uløselige Ap-fibriller som korrelerer dårlig med den kliniske tilstand av pasientene, er løselig Aβo tilberedt fersk og injiseres en gang per dag i løpet av seks dager å produsere markert celledød i hippocampus. Vi brukte kanylen spesielt design for samtidige infusjoner av Aβo og kontinuerlig infusjon av Aβo antistoff (6E10) i hippocampus ved hjelp av osmotiske pumper. Denne innovative in vivo metoden kan nå brukes i prekliniske studier for å validere effektiviteten av nye AD behandlinger som kan hindre deponering og neurotoksisitet av Aβo i pre-demente.
Det ble opprinnelig foreslått at akkumulering av uløselige Ap-arter i hjernen var sentral i AD patogenesen. 1,2 Men amyloid plakk også påvist i noen kognitivt normale eldre. 3-7 For å overvinne dårlig korrelasjon eksisterende mellom plakk avsetninger og kognitive mangler i AD, har nye rapporter vist at tilstedeværelsen av giftige oppløselig Aβo ved utbruddet av sykdommen, som korrelerer mye bedre med den kliniske tilstanden til pasienten. 8-14 Siden prosessen med Ap oligomerisering er meget dynamisk, ble det foreslått at neurotoksisitet induseres ved forskjellige Aβo i stedet for bare en bestemt type oligomer. 14-16 Siden mange studier har vist at Aβo kan initiere synapse dysfunksjoner før synapse og nevronale tap, 17-24 aktuelle teorier indikerer at Ap-relatert behandling kan være effektiv i tidlig AD snarere enn på senere stadier som testet så langt i kliniske studier.
Ett kjennetegn trekk ved AD patogenesen er den massive og utbredt celledød observert i de sene stadier av sykdommen, og den betydelige synapse og nevronale tap observert i lokaliserte områder av hjernen når hukommelsessvikt blir påviselig på klinisk nivå. Perforantveien pathway at prosjekter fra entorhinal cortex (EC) til dentate gyrus (DG) er opprørt markert ved tidlig debut av Alzheimers. 25,26 Under prodromal tilstanden AD når mild kognitiv svikt (MCI) blir tydelig betydelig celledød oppdages i EF samt synaptisk tap i DG. 25,26
Selv om en stor mengde bevis har pekt den giftige virkningen av løselig Aβo tidlig i AD, 8-14 Aβo-indusert nevrodegenerasjon observert i neuronal kultur eller organotypiske hjernen skive kultur har vært mer utfordrende å reprodusere i dyremodeller. 27 Mesteparten av transgene AD modeller overekspresjon Aβ har amyloid plakk, tau-hyperfosforylering, synaptiske mangel og hukommelsessvikt. 27 Imidlertid har disse modellene vært mindre vellykket i modellering celledød observert i hippocampus fra AD pasienter. For å overvinne disse tekniske problemene vi utviklet en modell basert på intracerebrale infusjoner av løselig Aβo. Vi rapporterte tidligere at gjentatte hippocampus infusjoner av løselig Aβo indusere gradvis neuronal tap og tau hyperfosforylering, to patologiske kjennetegn assosiert med minne nedgang i AD. 28 Her viser vi en ny metode for å teste AD behandlinger ved hjelp av kanyle spesielt design for samtidig infusjon av Aβo og kontinuerlig infusjon av Aβo antistoff (6E10) med osmotiske pumper.
Osmotiske pumper gir en unik måte å teste in vivo effektiviteten av noe antistoff (eller andre forbindelser) mot Aβo-indusert nevrodegenerasjon direkte på infusjonsstedet Aβo. Dermed disse pumper reprESENT et praktisk verktøy for å etablere en solid proof-of-concept om virkningsmekanismer av potensielle terapeutiske midler i AD. Siden siste rapportene påpeke den kritiske effekten av løselig Aβo i de tidlige stadier av Alzheimers, er mange behandlinger rettet mot Aβo faktisk blir testet av akademiske og farmasøytiske laboratorier. Denne romanen dyremodell gjør det mulig å etterligne den synaptiske og nevronale tap observert tidlig i AD, og osmotiske pumper brukes til å sette mot kontinuerlig behandlingsmidler spesielt på Aβo innstikkstedet. De gjentatte feil av AD behandlinger testet i løpet av de siste årene i mild til moderat pasienter som blir bedt forskere til å sette i gang forsøk i pre-demente før Aβo begynner å hope seg opp i overflod og generere irreversibel hjerneskade. I denne sammenheng, kan testing av nye forbindelser som hindrer avsetningen og følgelig neurotoksisitet av Aβo være av interesse i prekliniske pasienter.
Det er viktige skritt i denne protokollen som krevde spesiell oppmerksomhet. Når implanteres kanylen, unngå å sette dental sement når det er for væske for å unngå å blokkere hullet på andre kanyle. Det er viktig å plassere dentalsement ved den frie ende av kateteret P50 festet til pumpen for å forhindre irritasjon og en mulig inflammatorisk respons. Dagen i stereotaxic kirurgi, bruker dummy kanyle som er like lang som guide kanyle for å unngå blokkering kanyle. Imidlertid, etter installere pumper benytter kortere dummy kanyle det stoppe før den vinkel arm av kanylen for å muliggjøre korrekt infusjon av oppløsningen fra pumpen til hippocampus. Følge nøye Aβo infusjoner og kontrollere at luftboblen gjort i katetre går kontinuerlig under infusjoner. Pass alltid på at injisering kanylen er satt helt inn i guiden kanylen under infusjoner.
Hvis problemet er møte i løpet av Ap infusjonKontroller at den interne kanylen ikke er blokkert. Hvis det er tilfelle, å spyle sterilt destillert vann gjennom den innvendige kanyle. Hvis guide kanyle er blokkert, må du slå den interne kanylen inn i guiden kanyle. Ellers bevege den indre kanyle opp og ned. Strid i kose kan være stressende for rotter, spesielt på den første dagen. For å redusere stress av dyret, anbefaler vi å manipulere og tilvenne rotter til kose før stereotaxic kirurgi.
Mange fordeler kan tilskrives det nye og fleksible in vivo tilnærming. Faktisk, arten av Aβo injiserte kan nøyaktig kontroll før infusjon, og forskjellige typer av Ap-preparater (for eksempel syntetisk vs hjerne-avledet Ap-løsninger) kan injiseres for å evaluere deres neurotoksisitet in vivo. Denne modellen kan også brukes til å undersøke mekanismer som ulike Ap-arter (for eksempel monomerer, lav og høy molekylvekt oligomers, protofibrils) kan indusere nevrotoksiske effekter in vivo, og hvordan behandlinger som immunterapi kan motvirke deres skadelig innvirkning på hjernen. Siden infusjoner er utføre i våken, fritt bevegelige dyr, er det ingen konfunderende effekter mellom anestesimidler og Aβo løsning på signalveier, som vist i tidligere studier. 32,33 infusjoner i fritt bevegelige dyr er også kompatibel med atferds testing helst tid før og etter infusjoner.
Infusjoner av Aβo og pumpeinstallasjon kan gjøres på dyr av ulike aldre for å fastslå effekten av Aβo og behandlinger i løpet av aldring. Siden nevrodegenerasjon skjer i nærheten av infusjonsstedet, kan synapse og nevronale tap induseres i ulike og lokaliserte områder av hjernen. Pantet infusjon av Aβo og kontroll (kjøretøy eller rykke Ap) gjør det mulig å kontrollere for eventuelle endringer innenfor samme dyret. Motsatt Aβo eller kontroll solutions kan injiseres bilateralt i høyre og venstre hippocampus, for eksempel ved testing av dyr i atferds oppgaver. Infusjon av Aβo og behandlingen kan gjøres på samme tid eller alternativt pumper kan installeres etter Aβo infusjon for å vurdere om behandlingen er effektiv etter Ap deponering. Den samme protokollen beskrevet her kan også brukes når du gjør intracerebroventrikulær infusjoner av Aβo. Effekten av Aβo den intracellulære signalveier kan evalueres før og etter nevronale tap i løpet av en rimelig kort tidsperiode. Dosen og antall av Ap-infusjoner kan også justeres for å oppnå en mer eller mindre alvorlige Ap patogenisitet.
Selv om svært allsidig, har denne teknikken noen begrensninger. Kanyle implantasjon produserer en mekanisk ødeleggelse av vevet og nevroinflammasjon i de første dagene etter operasjonen. Derfor er det viktig å vente minst en uke etter operasjonen før du starter Aβo infusjon, og å legge til rette kontroller (injeksjon av kjøretøy eller inaktive rykke Ap) å ta hensyn til disse hendelsene. Dessuten kan bare et lite volum av Aβo bli tilført for å begrense diffusjon av oppløsningen.
De osmotiske pumper representerer en praktisk og unik leveringsmåte for preklinisk validering av midler som skal hindre Ap-indusert neurodegeneration. Siden immunterapi med 6E10 antistoffet har vist seg tidligere for å redusere Ap akkumulering i hjernen, 31 vi brukte 6E10 antistoffet som et proof-of-concept å validere vår nye in vivo tilnærming. Den brukes av osmotiske pumper i denne modellen kan nå brukes til å utvikle nye sykdomsmodifiserende behandling som kan hindre deponering og neurotoksisitet av Aβo i prekliniske AD pasienter.
The authors have nothing to disclose.
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |