To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Nedgång i hippocampus-beroende explicit minne (minne för fakta och händelser) är en av de tidigaste kliniska symtom på Alzheimers sjukdom (AD). Det är väl etablerat att synaps förlust och efterföljande neurodegeneration är de bästa prediktorer för minnes försämringar i AD. Senaste undersökningarna har betonat den neurotoxiska rollen av lösliga amyloid-beta oligomerer (Aβo) som börjar att ackumuleras i den mänskliga hjärnan ca 10 till 15 år innan de kliniska symptomen att bli uppenbara. Många rapporter visar att löslig Aβo korrelerar med minnesbrister i AD modeller och människor. Den Aβo-inducerad neurodegeneration observerades i neuronala och hjärn slice kulturer har varit svårare att reproducera i många djurmodeller. Modellen upprepade Aβo infusioner visas här övervinna detta problem och göra det möjligt att ta itu med två nyckelområden för att utveckla nya terapier sjukdomsmodifierande: identifiera biologiska markörer för att diagnostisera tidig AD, och bestämma molekyl mechanismer som ligger till grund Aβo-inducerade minnesbrister i början av AD. Eftersom lösligt Aβo aggregat relativt snabbt till olösliga Ap fibriller som korrelerar dåligt med kliniska tillstånd av patienter, är lösliga Aβo beredas och injiceras en gång per dag under sex dagar för att producera markant celldöd i hippocampus. Vi använde kanyl speciellt design för samtidiga infusioner av Aβo och kontinuerlig infusion av Aβo antikropp (6E10) i hippocampus med hjälp av osmotiska pumpar. Denna innovativa in vivo-metod kan nu användas i prekliniska studier för att validera effektiviteten av nya AD terapier som kan hindra avsättningen och neuro av Aβo i pre-demenssjuka.
Det var från början föreslagit att ackumulering av olösliga AP arter i hjärnan var central för AD patogenes. 1,2 Men amyloida plack också upptäckts i vissa kognitivt normala äldre. 3-7 För att övervinna den dåliga korrelationen som finns mellan plack nedfall och kognitiva brister i AD, har senaste rapporterna visat förekomsten av giftiga löslig Aβo vid uppkomsten av sjukdomen, som korrelerar mycket bättre med kliniska tillstånd av patienterna. 8-14 Eftersom processen av A-beta oligomerisering är mycket dynamisk, föreslogs det att neuro induceras av olika Aβo i stället för bara en viss typ av oligomer. 14-16 Eftersom många studier har visat att Aβo kan initiera synaps dysfunktioner före synaps och neuronal förlust, 17-24 nuvarande teorier tyder på att Ap-relaterade behandling kan vara effektivt i tidig AD snarare än i senare skeden som testat hittills i kliniska prövningar.
Ett kännetecknande drag hos AD patogenes är den massiva och omfattande celldöd observerades i sena stadier av sjukdomen, och den betydande synapsen och neuronal förlust observerades i lokaliserade områden i hjärnan när minnesbrister blir detekterbara på klinisk nivå. Den perforanta väg som skjuter ut från entorhinal cortex (EG) till dentate gyrus (DG) störs kraftigt vid tidig debut av AD. 25,26 Under prodromala tillstånd av AD när mild kognitiv svikt (MCI) blir uppenbar betydande celldöd detekteras i EG samt synaptiska förlust i GD. 25,26
Även om en stor mängd bevis har koncentrerats den toxiska effekten av löslig Aβo i början av AD, 8-14 Aβo-inducerad neurodegeneration observerades i neuronal kultur eller organotypic hjärna skiva kultur har varit svårare att föröka sig i djurmodeller. 27 Huvuddelen av den transgena AD modeller som överuttrycker Aβ har amyloida plack, tau-hyperfosforylering, synaptiska brist och minnesbrister. 27 Emellertid har dessa modeller varit mycket mindre framgångsrika i modellering celldöd observerades i hippocampus hos AD-patienter. För att lösa dessa tekniska problem har vi utvecklat en modell baserad på intracerebrala infusioner av lösligt Aβo. Vi rapporterade tidigare att upprepas hippocampus infusioner av löslig Aβo framkalla gradvis neuronal förlust och tau-hyperfosforylering, två patologiska kännetecken i samband med minnes nedgång i AD. 28 Här visar vi en ny metod för att testa AD behandlingar med hjälp av kanyl speciellt design för samtidiga infusioner av Aβo och kontinuerlig infusion av Aβo antikropp (6E10) med osmotiska pumpar.
Osmotiska pumpar ger ett unikt sätt att testa in vivo effektiviteten av någon antikropp (eller andra föreningar) mot Aβo-inducerad neurodegeneration direkt vid infusionsstället Aβo. Således är dessa pumpar reprESENT ett praktiskt verktyg för att skapa en solid proof-of-concept beträffande verkningsmekanismer av potentiella terapeutiska medel i AD. Eftersom nya rapporter pekar ut den kritiska effekten av löslig Aβo i de tidiga stadierna av AD, är många behandlingar riktade mot Aβo faktiskt testas av akademiska och läkemedelslaboratorier. Denna nya djurmodell kan härma den synaptiska och neuronal förlust observerades i början av AD, och osmotiska pumpar används för att ingjuta kontinuerligt behandlingsmedel specifikt vid Aβo infusionsstället. De upprepade misslyckanden AD terapier testats under de senaste åren i mild till måttlig patienter uppmanas forskare att inleda studier i pre-demenspatienter innan Aβo börjar hopa rikligt och generera obotliga hjärnskador. I detta sammanhang kan testa nya föreningar som förhindrar avsättningen och följaktligen neurotoxiciteten hos Aβo vara av intresse i prekliniska patienter.
Det finns viktiga steg i detta protokoll som krävs för särskild uppmärksamhet. Vid implantering av kanylen, undvika att tandcement när det är för vätska för att förhindra blockering av hålet i den andra kanylen. Det är viktigt att placera dentalcement vid den fria änden av P50 katetern fäst vid pumpen för att förhindra irritation och en möjlig inflammatoriskt svar. Dagen för stereotaktisk kirurgi, använda dummy kanyl som har samma längd som guide kanyl för att undvika att kanylen. Men efter att ha installerat pumpar använder kortare dummy kanyl som slutar innan vinkelarmen av kanylen för att medge korrekt infusion av lösningen från pumpen till hippocampus. Noga övervaka Aβo infusioner och kontrollera att luftbubblan gjort i katetrar kontinuerligt rör sig under infusioner. Se alltid till att den injicera kanylen är helt införd i styrkanylen under infusioner.
Om problemet är möter under Ap infusion, Kontrollera att den interna kanylen inte är blockerad. Om det är fallet, spola sterilt destillerat vatten genom den inre kanylen. Om styrkanylen hindras, vrid inre kanylen i styr kanylen. Annars flyttar inre kanylen uppåt och nedåt. Conten i Snuggle kan vara stressande för råttor, särskilt på den första dagen. För att minska stressen hos djuret, rekommenderar vi att manipulera och vänja råttor till gosa innan stereotaxic kirurgi.
Många fördelar kan tillskrivas denna roman och flexibel in vivo tillvägagångssätt. Faktiskt, arten av Aβo injiceras exakt kan styra före infusion, och annan typ av A-beta preparat (till exempel syntetiska vs hjärnhärledda Ap-lösningar) kan injiceras för att utvärdera deras neurotoxicitet in vivo. Denna modell kan också användas för att undersöka mekanismer genom vilka olika Ap-arter (t.ex. monomerer, låg och hög molekylvikt oligomers, protofibriller) kan inducera neurotoxiska effekter in vivo, och hur behandlingar som immunterapi kan motverka deras skadliga inverkan på hjärnan. Eftersom infusioner utföra i vaket, fritt rörliga djur, det finns inga störande effekter mellan anestesimedel och Aβo lösningen på signalvägar, som visas i tidigare studier. 32,33 Infusioner i fritt rörliga djur är också kompatibel med beteendetestning någon tiden före och efter infusionerna.
Infusioner av Aβo och pumpinstallation kan göras på djur i olika åldrar för att bestämma effekterna av Aβo och behandlingar under åldrandet. Eftersom neurodegeneration sker i närheten av injektionsstället, kan synaps och neuronal förlust induceras i olika och lokaliserade områden i hjärnan. De säkerheter infusion av Aβo och kontroll (fordon eller förvränga AP) möjliggör styrning för varje förändring inom samma djur. Omvänt Aβo eller kontroll solutions kan injiceras bilateralt i höger och vänster hippocampus, till exempel när man testar djur i beteende uppgifter. Infusion av Aβo och behandling kan göras samtidigt eller alternativt pumpar kan installeras efter Aβo infusion för att utvärdera om behandlingen är effektiv efter Ap-avsättning. Samma protokoll som beskrivs här kan också användas när man gör intracerebroventrikulär infusioner av Aβo. Effekten av Aβo på intracellulära signalvägar kan utvärderas före och efter neuronal förlust inom en rimlig tidsram. Dosen och antalet Ap infusioner kan också justeras för att erhålla en mer eller mindre allvarliga Ap patogenicitet.
Även om mycket mångsidig, har denna teknik vissa begränsningar. Kanyl implantation producerar en mekanisk störning av vävnaden och neuroinflammation under de första dagarna efter operationen. Således är det viktigt att vänta minst en vecka efter operationen innan Aβo infusionen, och att lägga till riktiga kontroller (injektion av fordon eller inaktiv scramble Ap) för att ta hänsyn till dessa händelser. Dessutom kan endast en liten volym av Aβo infunderas för att begränsa diffusion av lösningen.
De osmotiska pumpar utgör en bekväm och unik leveransmetod för preklinisk validering av medel utformade för att förhindra Ap-inducerad neurodegeneration. Eftersom immunterapi med 6E10 antikroppen har visats tidigare att minska Ap-ackumulering i hjärnan, 31 vi använde 6E10 antikropp som en proof-of-concept för att validera vårt nya in vivo tillvägagångssätt. Den använda av osmotiska pumpar i denna modell kan nu användas för att utveckla nya sjukdomsmodifierande terapier som kan förhindra avsättningen och neuro av Aβo i prekliniska AD patienter.
The authors have nothing to disclose.
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |