To study the effects of Aβo in vivo, we developed a model based on repeated hippocampal infusions of soluble Aβo coupled with continuous infusion of Aβo antibody (6E10) in the hippocampus using osmotic pumps to counteract the neurotoxic effect of Aβo.
Nedgang i hippocampus-afhængig eksplicitte hukommelse (hukommelse til fakta og begivenheder) er en af de tidligste kliniske symptom på Alzheimers sygdom (AD). Det er velkendt, at synapse tab og efterfølgende neurodegeneration er de bedste prædiktorer for hukommelsessvækkelser i AD. Seneste undersøgelser har understreget den neurotoksiske rolle af opløselige amyloid-beta oligomerer (Aβo), som begynder at ophobes i den menneskelige hjerne ca. 10 til 15 års før de kliniske symptomer viser sig. Mange rapporter indikerer, at opløseligt Aβo korrelerer med hukommelsessvigt i AD-modeller og mennesker. Den Aβo-induceret neurodegeneration observeret i neuronale og hjerne skive kulturer har været mere udfordrende at gengive i mange dyremodeller. Modellen af gentagne Aβo infusioner vist her overvinde dette problem og tillade adressering to centrale områder for udvikling af nye sygdomsmodificerende behandlinger: identificere biologiske markører til at diagnosticere tidligt AD, og bestemme den molekylære mechanismer understøtte Aβo-induceret hukommelse underskud ved starten af AD. Da opløseligt Aβo aggregat relativt hurtigt til uopløselige Ap fibriller, der korrelerer dårligt med den kliniske tilstand af patienter, er opløseligt Aβo frisklavet og injiceret en gang om dagen i seks dage for at frembringe markant celledød i hippocampus. Vi brugte kanyle specielt designe for samtidige infusioner af Aβo og kontinuerlig infusion af Aβo antistof (6E10) i hippocampus hjælp osmotiske pumper. Denne innovative in vivo-metoden kan nu anvendes i prækliniske undersøgelser for at validere effektiviteten af nye AD behandlinger, der kan forhindre aflejring og neurotoksicitet af Aβo i præ-demente.
Det blev oprindeligt foreslået, at ophobning af uopløselige Ap arter i hjernen var central for AD patogenese. 1,2 er dog amyloid plaques også påvist i nogle kognitivt normal ældre. 3-7 For at overvinde den ringe korrelation eksisterer mellem plak depositioner og kognitive mangler i AD, har seneste rapporter vist tilstedeværelsen af giftige opløseligt Aβo ved sygdommens opståen, som korrelerer meget bedre med den kliniske tilstand af patienterne. 8-14 Da processen af Ap oligomerisering er meget dynamisk, blev det foreslået, at neurotoksicitet induceres af forskellige Aβo stedet for kun én bestemt type oligomer. 14-16 Da mange undersøgelser har vist, at Aβo kan initiere synapse dysfunktioner før synapse og neurontab, 17-24 nuværende teorier indikerer, at Ap-relateret behandling kan være effektiv i tidlig AD snarere end på senere trin testet hidtil i kliniske forsøg.
Et kendetegnende træk ved AD patogenese er den massive og udbredt celledød observeret i de sene stadier af sygdommen, og den betydelige synapser og neuronal tab observeret i lokaliserede områder af hjernen, når hukommelse underskud bliver påvises på det kliniske niveau. Den perforant vej, der rager ud fra entorhinal cortex (EF) til tandede gyrus (DG) er foruroliget markant i de tidlige debut af AD. 25,26 Under den prodromale tilstand af AD, når mild kognitiv svækkelse (MCI) viser sig betydelig celledød detekteres i EF samt synaptisk tab i GD. 25,26
Selv om en stor mængde beviser har sat fingeren den toksiske virkning af opløselig Aβo tidligt AD, 8-14 Aβo-induceret neurodegeneration observeret i neuronal kultur eller organotypisk hjerne skive kultur har været mere udfordrende at gengive i dyremodeller. 27 De fleste af de transgene AD modeller overekspression Aβ har amyloide plaques, tau-hyperphosphorylering, synaptisk mangel og hukommelsessvigt. 27 Imidlertid har disse modeller været langt mindre succes i modellering celledød observeret i hippocampus af AD-patienter. For at overvinde disse tekniske spørgsmål vi udviklet en model baseret på intracerebrale infusioner af opløselig Aβo. Vi rapporterede tidligere, at gentagne hippocampus infusioner af opløselig Aβo fremkalde gradvis neuronal tab og tau-hyperphosphorylering, to patologiske kendetegn forbundet med hukommelse fald i AD. 28 Her viser vi en ny metode til at teste AD behandlinger ved hjælp kanyle specielt designe for samtidige infusioner af Aβo og kontinuerlig infusion af Aβo antistof (6E10) med osmotiske pumper.
Osmotiske pumper give en unik måde at teste in vivo effektivitet som helst antistof (eller andre forbindelser) mod Aβo-induceret neurodegeneration direkte på infusionsstedet af Aβo. Således disse pumper ReprESENT et praktisk værktøj til at etablere en solid proof-of-concept vedrørende virkningsmekanismer af potentielle terapeutiske midler i AD. Siden seneste rapporter påpeger den kritiske effekt af opløselig Aβo i de tidlige stadier af AD, er mange behandlinger rettet mod Aβo faktisk testet af akademiske og farmaceutiske laboratorier. Denne roman dyremodel tillader efterligne den synaptiske og neuronale tab observeret i begyndelsen af AD, og osmotiske pumper anvendes til løbende at indgyde behandlingsmidler specifikt på Aβo infusionsstedet. De gentagne svigt i AD testet løbet af de sidste par år i mild til moderat patienter som bliver bedt forskere til at indlede forsøg i pre-demente patienter behandlinger før Aβo begynder at akkumulere rigeligt og generere uoprettelige hjerneskader. I den forbindelse kan afprøve nye forbindelser, der forhindrer aflejringen og følgelig neurotoksiciteten af Aβo være af interesse i prækliniske patienter.
Der er kritiske trin i denne protokol, som krævede særlig opmærksomhed. Når implantering kanylen, undgå at sætte dentalcement når det er for flydende til at forhindre blokering af hullet i den anden kanyle. Det er vigtigt at placere dental cement ved den frie ende af P50 kateter fæstnet til pumpen for at undgå irritation og en mulig inflammatorisk respons. Dagen for stereotaktisk kirurgi, bruge dummy kanyle, der har samme længde som styrekanyle at undgå blokering kanyle. Men efter installation pumper bruger kortere dummy kanyle, der stopper før vinkel arm af kanylen for at muliggøre korrekt infusion af opløsningen fra pumpen til hippocampus. Overvåg nøje Aβo infusioner og kontrollere, at luftboblen gjort i katetre bevæger kontinuerligt under infusioner. Sørg altid for, at indsprøjte kanylen er sat helt ind i guide kanyle under infusioner.
Hvis problemet er møde i Ap infusionKontrollere, at den interne kanyle ikke er blokeret. Hvis det er tilfældet, skylle sterilt destilleret vand gennem det indre kanyle. Hvis guide kanylen er blokeret, drej den interne kanyle ind i føringen kanyle. Ellers flytte det indre kanyle op og ned. Contention i putte kan være stressende for rotter, især på den første dag. For at mindske stress af dyret, anbefaler vi at manipulere og vænne rotter til putte før stereotaktisk kirurgi.
Mange fordele kan tilskrives denne hidtil ukendte og fleksibel in vivo tilgang. Faktisk, arten af Aβo injicerede nøjagtigt kan styre før infusion, og anden type Ap præparater (f.eks syntetisk vs hjerne-afledt Ap opløsninger) kan injiceres for at vurdere deres neurotoksicitet in vivo. Denne model kan også anvendes til at undersøge mekanismerne, hvormed forskellige Ap arter (fx monomerer, lav og høj molekylvægt oligomers, protofibriller) kan inducere neurotoksiske virkninger in vivo, og hvordan behandlinger som immunterapi kan modvirke deres skadelige virkninger i hjernen. Eftersom infusioner udføre i vågne, frit bevægelige dyr, er der ingen forstyrrende effekter mellem bedøvelsesmidler og Aβo løsning på signalveje, som vist i tidligere undersøgelser. 32,33 Infusioner i frit bevægelige dyr er også kompatibel med adfærdsmæssige test nogen tiden før og efter infusionerne.
Infusioner af Aβo og pumpe installation kan gøres på dyr af forskellige aldre til at bestemme virkningerne af Aβo og behandlinger under aldring. Da neurodegeneration sker i nærheden af infusionsstedet, kan synapse og neuronal tab induceres i forskellige og lokaliserede hjerneområder. Den sikkerhedsstillelse infusion af Aβo og kontrol (køretøj eller klatretur Ap) tillader styring for enhver ændring i det samme dyr. Omvendt Aβo eller kontrol solutions kan injiceres bilateralt i højre og venstre hippocampus, for eksempel ved test dyr i adfærdsmæssige opgaver. Infusion af Aβo og behandling kan ske samtidigt eller alternativt pumper kan monteres efter Aβo infusion til vurdere, om behandlingen er effektiv efter Ap deposition. Den samme protokol beskrevet her kan også anvendes, når de udfører intracerebroventrikulær infusioner af Aβo. Effekten af Aβo på intracellulære signalveje kan vurderes før og efter neuronal tab inden for en rimelig kort tidshorisont. Dosis og antallet af Ap infusioner kan også justeres for at opnå en mere eller mindre alvorlig Ap patogenicitet.
Selvom meget alsidig, denne teknik har visse begrænsninger. Kanyle implantation frembringer en mekanisk ødelæggelse af vævet og neuroinflammation i de første dage efter operationen. Således er det vigtigt at vente mindst en uge efter operationen, før du starter Aβo Infunen, og at tilføje ordentlig kontrol (injektion af køretøj eller inaktiv scramble Ap) at tage hensyn til disse begivenheder. Desuden kan kun et lille volumen af Aβo infunderes til at begrænse diffusion af opløsningen.
De osmotiske pumper udgør en bekvem og unik leveringsmetode for præklinisk validering af agenter til formål at forhindre Ap-induceret neurodegeneration. Da immunterapi med 6E10 antistof er blevet vist tidligere at falde Ap ophobning i hjernen, 31 brugte vi 6E10 antistoffet som en proof-of-concept til at validere vores nye in vivo metode. Den anvendte af osmotiske pumper i denne model kan nu bruges til at udvikle nye sygdomsmodificerende behandlinger, som kunne forhindre aflejring og neurotoksicitet af Aβo i prækliniske AD patienter.
The authors have nothing to disclose.
We thank Caroline Bouchard from the animal facility for the rat work. A.S. holds a J.A. De Sève master fellowship, and B.P. a COPSE fellowship from the Université de Montréal This work was funded by grants attributed to J.B. from FRQS-Pfizer and start-up funds from Hôpital du Sacré-Coeur de Montréal Research Center.
Artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) | Harvard Apparatus | 59-7316 | |
PE50 Catheter thin wall | Plastics one | C232CT | |
Ketamine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bioniche | 1989529 | |
Xylaxine Hydrochloride (100 mg/mL) | Bimeda | 8XYL004C | |
Meloxicam (5 mg/mL) | Norbrook | 215670I01 | |
Solution of chlorhexidine gluconate 2% and isopropyl alcohol 2% | Carefusion | 260100C | |
Lidocaine Hydrochloride | Alveda Pharma | 0122AG01 | |
Bupivacaine Hydrochloride | Hospira | 1559 | |
ophthalmic ointment | Baussh and Lomb inc. | 2125706 | |
stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | |
stereotaxic cannula holder arm | Harvard Apparatus | 72-4837 | |
Drill | Dremel | 8050-N/18 | |
Guide Cannula | Plastics one | 326OPG/spc | |
Injection Cannula | Plastics one | C315I/spc | |
Dummy Cannula | Plastics one | C315DC/spc | |
Suture thread coated vicryl rapide 4-0 | Ethicon | VR2297 | |
Dental Acrylic Cement | Harvard Apparatus | 72-6906 | |
Screws | JI Morris Company | P0090CE125 | |
6E10 antibody (mouse IgG1 isotype) | BioLegend | 803003 | |
Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | AB18447 | |
Alzet osmotic pumps model 1007D | Durect corporation | 290 | |
Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
Amyloid-beta 1-42 | rPeptide | A-1163-1 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Fisher Scientique | 14815279 | |
Infusion Syringe Pump CMA 402 | Harvard Apparatus | CMA8003110 | |
Syringe 1 mL | BD | 309659 | |
Needle 21G | Terumo | NN-2125R | |
Snuggle | Lomir Biomedical | RTS04 |