Axenic और gnotobiotic की शर्तों के तहत ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के पालन के लिए एक विधि प्रस्तुत किया है। भ्रूण उड़ना, सोडियम हाइपोक्लोराइट में dechorionated बाँझ आहार के लिए aseptically का तबादला, और बंद कंटेनर में पाला जाता है। बैक्टीरिया के साथ आहार और भ्रूण inoculating gnotobiotic संघों की ओर जाता है, और बैक्टीरियल उपस्थिति पूरे शरीर ड्रोसोफिला homogenates चढ़ाना द्वारा पुष्टि की है।
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
अधिकांश जानवरों परिचित जन्म से बैक्टीरिया ( 'माइक्रोबायोटा') मृत्यु 1 के साथ जुड़े रहे हैं। सूक्ष्मजीव मुक्त ( 'axenic') और सूक्ष्मजीव जुड़े ( 'पारंपरिक') जानवरों की तुलना से पता चला है रोगाणुओं चयापचय, पोषण, नाड़ी, यकृत, सांस, प्रतिरक्षा, अंत: स्रावी, और तंत्रिका संबंधी समारोह 2 सहित पशुओं के स्वास्थ्य के विभिन्न पहलुओं, प्रभावित करते हैं। फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर रोगाणुओं 3,4 की उपस्थिति में इन प्रक्रियाओं के कई समझने के लिए और पशुओं के स्वास्थ्य पर 5,6 माइक्रोबायोटा प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है। कोई बैक्टीरियल प्रजातियों हर व्यक्ति ( 'कोर') में मौजूद है, लेकिन एसीटोबैक्टर और लैक्टोबैसिलस प्रजातियों संख्यानुसार दोनों प्रयोगशाला-पाला और जंगली पकड़ा डी के माइक्रोबायोटा हावी मेलानोगास्टर। अन्य Acetobacteraceae, Firmi (Komagataeibacter और Gluconobacter सहित)और Enterobacteriaceae (जैसे उदर और Leuconostoc के रूप में) cutes या तो उच्च बहुतायत 7-12 से कम बहुतायत में ड्रोसोफिला व्यक्तियों में अक्सर मौजूद है, या अनियमित मौजूद हैं।
ड्रोसोफिला और स्तनधारियों की माइक्रोबायोटा भीतर और पीढ़ियों 14,19 भर में अस्थिर है। माइक्रोबायोटा चंचलता जब माइक्रोबायोटा निर्भर लक्षण मापने प्ररूपी शोर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला 15-18 में Acetobacteraceae प्रभाव लिपिड (ट्राइग्लिसराइड) भंडारण। Acetobacteraceae एक और 19 में से एक शीशी की मक्खियों में अधिक प्रचुर मात्रा में हैं, तो isogenic मक्खियों अलग phenotypes 20 हो सकती है। चूहों 14 में माइक्रोबायोटा चंचलता की समस्या का समाधान, 1960 के बाद से अभ्यास में किया गया है, माउस पिल्ले के लिए प्रत्येक नई पीढ़ी (बदल Schaedler वनस्पति) 8 प्रमुख माइक्रोबियल प्रजातियों में से एक परिभाषित समुदाय को शुरू करने सेयह सुनिश्चित करना कि एक पिल्ला माउस माइक्रोबायोटा की एक ही कुंजी के सदस्यों के संपर्क में है। इस अभ्यास माइक्रोबायोटा रचना के लिए नियंत्रित करता है तब भी जब माइक्रोबायोटा अध्ययन 32 का प्राथमिक लक्ष्य नहीं है, और मिसाल सेट प्रयोगात्मक स्थितियों की एक किस्म में महत्वपूर्ण रोगाणुओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए।
ड्रोसोफिला पोषण पर रोगाणुओं के प्रभाव को परिभाषित करने के लिए, axenic उड़ लाइनों पाने के लिए कई प्रोटोकॉल भ्रूण के हाइपोक्लोराइट dechorionation (या तो नए सिरे से निकाली गई हर पीढ़ी या बाँझ आहार के लिए स्थानांतरण द्वारा बनाए रखा generationally) और एंटीबायोटिक उपचार के 13 सहित विकसित किया गया है। ऐसे एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार और धारावाहिक हस्तांतरण, नए सिरे से dechorionation साथ confounding चर (जैसे, अंडा घनत्व, अवशिष्ट दूषित रोगाणुओं, बंद लक्ष्य एंटीबायोटिक प्रभाव) की तुलना में अधिक से अधिक नियंत्रण दोनों के लिए आसानी और तेज़ी के रूप में अलग अलग दृष्टिकोण करने के लिए लाभ कर रहे हैं। की विधि के बावजूदतैयारी, निर्दिष्ट माइक्रोबियल प्रजातियों की शुरूआत भ्रूण axenic को परिभाषित ( 'gnotobiotic') समुदायों के साथ ड्रोसोफिला की संस्कृति परमिट। वैकल्पिक रूप से, Schaedler वनस्पतियों का उपयोग नकल उतार, इस समुदाय पारंपरिक रखी अंडे प्रत्येक शीशी में विशेषता-प्रभावित रोगाणुओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने और माइक्रोबायोटा चंचलता की जटिलताओं से बचने के लिए (कदम 6-7 केवल निम्न) को टीका किया जा सकता है। यहाँ हम भ्रूण की नए सिरे से dechorionation द्वारा axenic और gnotobiotic ड्रोसोफिला जुटाने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है, और शुरू या दूषित माइक्रोबियल taxa की मौजूदगी की पुष्टि के लिए।
विधि यहाँ वर्णित भ्रूण dechorionation 8,11,18,25,26,27 के लिए कई तरीकों में से एक है, एक साथ axenic वयस्कों 18,27 के धारावाहिक हस्तांतरण या एंटीबायोटिक उपचार 13,18 सहित axenic मक्खियों, पालन करने के वैकल्पिक तरीकों के साथ?…
The authors have nothing to disclose.
इस प्रोटोकॉल के कुछ विवरण डॉ एडम Dobson, जो भी पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी प्रदान की सहायता के साथ अनुकूलित किया गया। (FNIH) अनुदान संख्या R01GM095372 (जेएमसी, ए (सीएन) डब्ल्यू, AJD, और एईडी) इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के लिए फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया। FNIH अनुदान संख्या 1F32GM099374-01 (पी डी एन), और ब्रिघम यंग विश्वविद्यालय स्टार्टअप फंड (जेएमसी, MLK, एमवी)। प्रकाशन लागत ब्रिघम यंग यूनिवर्सिटी कॉलेज लाइफ साइंसेज के और संयंत्र और वन्य जीव विज्ञान विभाग द्वारा समर्थित थे।
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