Aufzucht der Fruit Fly<em> Drosophila melanogaster</em> Unter Axenic und gnotobiotische Bedingungen
Summary
Verfahren zur Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenic und gnotobiotischer Bedingungen vorgestellt. Fly Embryonen werden in Natriumhypochlorit, aseptisch in sterile Ernährung dechorionated und aufgezogen in geschlossenen Behältern. Impfen Ernährung und Embryonen mit Bakterien führt zu gnotobiotischer Verbänden und bakterielle Präsenz wird durch Plattierung Ganzkörper- Drosophila Homogenate bestätigt.
Abstract
The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.
Introduction
Die meisten Tiere sind eng mit Bakterien ( 'Mikrobiota') von der Geburt bis zum Tod 1 verbunden. Vergleiche von Mikroorganismen frei ( 'axenic') und Mikroorganismen verbunden sind ( "konventionelle") Tiere haben Mikroben verschiedene Aspekte der Tiergesundheit beeinflussen gezeigt, einschließlich Stoffwechsel, Ernährung, Kreislauf-, Leber-, Atemwegserkrankungen, immunologische, endokrine und neurologische Funktion 2. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Schlüsselmodell für 3,4 in Gegenwart von Mikroben viele dieser Prozesse verstehen und Mikrobiota Einfluss auf die Tiergesundheit 5,6 für das Studium. Keine Bakterienarten ist in jedem einzelnen ( "Core"), aber Acetobacter und Lactobacillus – Arten , die Mikrobiota sowohl im Labor aufgezogen und wild gefangenen D. numerisch dominieren melanogaster. Andere Acetobacteraceae (einschließlich Komagataeibacter und Gluconobacter), Firmicutes (wie Enterococcus und Leuconostoc) und Enterobacteriaceae sind häufig entweder in Drosophila Individuen in geringer Menge vorhanden, oder unregelmäßig in hohen Fülle 12.07.
Die Mikrobiota von Drosophila und Säugetieren 14,19 innerhalb und zwischen den Generationen inkonstant. Mikrobiota Unbeständigkeit kann zu phänotypischen Rauschen führen, wenn Mikrobiota abhängigen Merkmale zu messen. Zum Beispiel kann der Acetobacteraceae Einfluss Lipid (Triglycerid) Lagerung in Drosophila 15-18. Wenn Acetobacteraceae häufiger in Fliegen eines Fläschchens sind als in einem anderen 19 kann isogenen Fliegen unterschiedlichen Phänotypen 20 haben. Eine Lösung für das Problem der Mikrobiota Unbeständigkeit bei Mäusen 14 hat sich seit den 1960er Jahren in der Praxis gewesen, indem eine definierte Gemeinschaft von 8 dominanten mikrobiellen Spezies Maus Welpen jede neue Generation (veränderte Schädler Flora) die Einführung,sicherzustellen, dass jeder Welpe den gleichen Schlüssel Mitglieder der Maus Mikrobiota ausgesetzt ist. Diese Praxis steuert für microbiota Zusammensetzung selbst wenn der Mikrobioten nicht das primäre Ziel der Studie 32 und setzt Präzedenzfall das Vorhandensein von Schlüssel Mikroben in einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu gewährleisten.
Um den Einfluss von Mikroben auf Drosophila Ernährung, verschiedene Protokolle zur Ableitung axenic Fliegenlinien definieren , wurden entwickelt, einschließlich Hypochlorit dechorionation von Embryonen (entweder abgeleitet de novo jeder Generation oder generations durch Übertragung auf sterile Nahrung gehalten) und Antibiotika – Behandlung 13. Es gibt Vorteile für unterschiedliche Ansätze, wie die Leichtigkeit und die Schnelligkeit für die beiden Antibiotika – Behandlung und eine serielle Übertragung, im Vergleich zu mehr Kontrolle über Störvariablen mit de novo dechorionation (zB Eierdichte, Rest kontaminierenden Mikroben, off-target antibiotische Wirkung). Unabhängig von der Methode derVorbereitung, Einführung bestimmter Mikrobenarten Embryonen Axenische erlaubt Kultur von Drosophila mit definierten ( 'gnotobiotischer') Gemeinden. Alternativ imitiert die Verwendung von Schädler Flora könnte diese Gemeinschaft zu konventionell gelegte Eier (entsprechend den Schritten 6-7 nur) geimpft werden, um die Anwesenheit von Charakterzug beeinflussenden Mikroben in jedem Fläschchen und vermeiden Komplikationen der Mikrobiota Unbeständigkeit zu gewährleisten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die durch de novo dechorionation von Embryonen axenischen und gnotobiotischen Drosophila Anheben und zur Bestätigung der Anwesenheit von eingeführt oder kontaminierende mikrobiellen Taxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren ist eines von mehreren Ansätzen für Embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, zusammen mit alternativen Methoden der axenic Fliegen Aufzucht, einschließlich der seriellen Übertragung von axenic Erwachsene 18,27 oder Antibiotika – Behandlung 13,18. Andere dechorionation Methoden schließen Ethanol wäscht und reduzieren 11,25,26 oder 8 Hypochlorit Behandlung verlängern. Verschiedene Waschschritte helfen können verschiedene Fl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Einige Details dieses Protokoll wurden mit Unterstützung von Dr. Adam Dobson optimiert, der auch hilfreiche Kommentare zum Manuskript zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Stiftung für die National Institutes of Health (FNIH) Gewährungsnummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD und AED) unterstützt wurde. FNIH Gewährungsnummer 1F32GM099374-01 (PDN) und Brigham Young University Startfonds (JMC, MLK, MV). Publikationskosten wurden von der Brigham Young University College of Life Sciences und Department of Plant and Wildlife Sciences unterstützt.
Materials
| Brewer's Yeast | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher–Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Grape Juice Concentrate | Walmart or other grocery store | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Cage: 32 oz. Translucent Round Deli Container | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| Translucent Round Deli Container Lid | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Stock Bottles | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Plastic Bushing | Home Depot | 100343125 | http://www.homedepot.com/p/Halex-2-1-2-in-Rigid-Insulated-Plastic-Bushing-75225/100343125 |
| Specimen Cup | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers–Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Laboratory Product Sales | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxes | USA Scientific | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter Pipette Tips, 300μl | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Petri Dishes | Laboratory Product Sales | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Paintbrush | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Forceps | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Household Bleach (6-8% Hypochlorite) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Peptone | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dipotassium Phosphate | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Ammonium Citrate | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| Sodium Acetate | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Manganese Sulfate | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match%20partialmax&lang=en®ion=US&focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_spectrophotometer.html |
| 1.7 ml Centrifuge Tubes | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter Pipette Tips, 1000μl | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96 Well Plates | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/13243/ |
| Ceramic Beads | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Tissue Homogenizer | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| Class 1 BioSafety Cabinet | Thermo Scientific | Model 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
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