VacuSIP, en forbedret Inex Metode til<em> In Situ</em> Måle partikler og opløst Forbindelser Bearbejdet af aktiv affjedring Feeders

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Bentiske suspension foderautomater spiller væsentlige roller i driften af marine økosystemer ^1. Ved at filtrere store mængder vand ^2,3, de fjerner og udskille partikler (plankton og detritus) og opløste forbindelser ¹ (og referencer deri) og er en vigtig agent for bentisk-pelagisk kobling ^4,5 og næringsstofkredsløb ^6,7. Præcist måle partikler og opløste forbindelser fjernet og udskilles af bentiske suspension foderautomater (såsom svampe, søpunge, børsteorme og muslinger) er grundlæggende for at forstå deres fysiologi, stofskifte, og fodring økologi. Sammen med at pumpe hastighedsmålinger, det også muliggør en kvantificering af de strømme næringsstoffer medieret af disse organismer og deres økologiske indflydelse på vandets kvalitet samt på økosystemet skala processer.

Valg af passende metode til måling fjernelse og produktion satser af partikler og opløst compounds ved suspension filter foderautomater er afgørende for at opnå pålidelige oplysninger om deres fodring aktivitet ^8. Som påpeget af Riisgård og andre, uhensigtsmæssige metoder skævhed resultater, fordrejer eksperimentelle betingelser, give forkerte skøn over indtagelse og udskillelse af visse stoffer, og kan føre til fejlagtig kvantificering af strømme næringsstoffer behandles af disse organismer.

De to hyppigst anvendte metoder til måling af partikler og opløste flusmidler næringsstoffer i filter foderautomater involvere enten inkubation (indirekte teknikker) eller samtidig samling af ambient og udåndet vand (direkte teknikker). Inkubationsbetingelser teknikker er baseret på at måle graden af ændring i koncentrationen af partikler og opløste næringsstoffer i inkuberes vand, og estimere satser produktion eller fjernelse i forhold til tilstrækkelig kontrol ^8. omslutter en organisme i en inkubation kammer kan dog ændre sit feeding og pumpning opførsel skyldes ændringer i den naturlige strøm ordning, som skyldes et fald i oxygen og / eller koncentrationen fødevarer, eller på grund af ophobning af udskillelse forbindelser i inkubationen vand ^7,9 (og referencer deri). Ud over virkningerne af indespærring og modificeret vandforsyning, en større forspænding inkuberingssystemernes teknikker stammer fra re-filtrerings- virkninger (se eksempel ^10). Selv om nogle af disse metodologiske problemer er blevet overvundet ved at bruge højre volumen og form inkubationsbeholderen ¹¹ eller med indførelsen af en recirkulerende glasklokken systemet in situ ^12, denne teknik ofte undervurderer fjernelse og produktionshastigheder. Kvantificering metabolismen af opløste forbindelser såsom opløst organisk nitrogen (DON) og carbon (DOC) eller uorganiske næringsstoffer, har vist sig at være særligt tilbøjelige til at bias forårsaget af inkubation teknikker ^13.

I slutningen af ​​60'erne og begyndelsen af ​​70'erne, Henry Reiswig^9,14,15 banebrydende anvendelsen af direkte teknikker til at kvantificere fjernelse partikel af gigantiske caribiske svampe ved separat prøveudtagning vandet inhaleres og udåndes af organismerne in situ. På grund af vanskeligheder med at anvende Reiswig teknik på mindre suspension foderautomater og i mere udfordrende undersøiske forhold, blev hovedparten af forskningen på dette område er begrænset til laboratoriet (in vitro) beskæftiger meste indirekte inkubation teknikker ^16. Yahel og kolleger ombygget Reiswig direkte in situ teknik til at arbejde i mindre målestok betingelser. Deres metode, betegnet Inex ^16, er baseret på samtidig undersøiske prøvetagning af vandet inhaleres (I) og udåndet (Ex) ved uberørte organismer. De forskellige koncentrationer af et stof (f.eks, bakterier) mellem et par prøver (Inex) giver et mål for opbevaring (eller produktion) af stoffet af dyret. Den Inex teknik anvender tidsubegrænsede rør ogafhængig af excurrent frembringes ved pumpning aktivitet af den undersøgte organisme til passivt erstatte det omgivende vand i indsamlingsenheden røret. Mens Yahel og kolleger med held har anvendt denne teknik i studiet af over 15 forskellige suspension fødere taxa (f.eks ^17), er den metode, begrænset af den høje grad af praksis og erfaring, der kræves ved den diminutive størrelse nogle excurrent åbninger, og ved hav forhold.

For at overvinde disse forhindringer, vi udviklet en alternativ teknik baseret på kontrolleret sug af den samplede vand gennem små rør (udvendig diameter <1,6 mm). Vores mål var at skabe en enkel, pålidelig og billig enhed, der ville tillade ren og kontrolleret in situ vandprøvetagning fra en meget bestemt punkt, som den excurrent åbning af bentiske suspension foderautomater. For at være effektiv, fremgangsmåden skal være ikke-påtrængende for ikke at påvirke den omgivende flow regime eller ændre Behavior af de undersøgte organismer. Enheden præsenteres her betegnes VacuSIP. Det er en forenkling af SIP udviklet af Yahel et al. (2007) ¹⁸ for ROV-baseret punkt prøvetagning i det dybe hav. Den VacuSIP er betydeligt billigere end den oprindelige SIP og det er blevet tilpasset til SCUBA-baserede arbejde. Systemet er designet efter principper præsenteret og testet af Wright og Stephens (1978) ¹⁹ og Møhlenberg og Riisgård (1978) ²⁰ for laboratoriet indstillinger.

Selvom VacuSIP system blev designet til in situ undersøgelser af metabolismen af bentiske Suspensionsædere, kan det også anvendes til laboratorieundersøgelser og hvor en kontrolleret og ren, punktkilde vandprøven er påkrævet. Systemet er især nyttig, når integration i længere perioder (min-timer) eller in situ-filtreringer er påkrævet. Den VacuSIP har været anvendt med succes i Yahel lab siden 2011, og har ogsåværet ansat i to nylige undersøgelser af næringsstoffluxe medieret af Caribien og Middelhavet svamp arter ²¹ (Morganti et al. indsendt).

Brugen af ​​specifikke samplere, den langvarige prøvetagning varighed, og markforhold, hvor VacuSIP anvendes, medfører nogle afvigelser fra standard oceanografiske protokoller til indsamling, filtrering og lagring af prøver til følsomme analytter. For at reducere risikoen for kontaminering fra den VacuSIP system eller risikoen for modifikation af det samplede vand ved bakteriel aktivitet efter indsamling, testede vi forskellige in situ filtrerings- og opbevaring procedurer. Forskellige filtrering enheder, indsamling fartøjer og lagring procedurer blev undersøgt med henblik på at opnå den bedst egnede teknik til analyse af opløst uorganisk (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, _NH4 ^+, SiO ₄₎ og organisk (DOC + DON) forbindelser, og ultra-plankton (<1081 m) og partikler organiske (POC + PON) prøvetagning. For yderligere at reducere risikoen for forurening, især under markforhold, blev antallet af håndteringstrin reduceret til et absolut minimum. Den visuelle format hvor fremgangsmåden præsenteres er orienteret til at lette reproducerbarhed og reducere den nødvendige tid til effektivt at anvende teknikken.

Systemoversigt

Prøve in situ pumpes vand fra Suspensionsædere med exhalant åbninger så små som 2 mm, er pumpning aktivitet af hver prøve først visualiseret ved at frigive filtreret fluorescein farvet havvand ud for den inhalant åbning (er) og observere dens strømning fra excurrent åbning ¹⁶ (se også figur 2B i ^18). Vandet inhaleres og udåndes af undersøgelsen prøven (incurrent og excurrent) er derefter samtidigt samples med brugen af ​​et par øjebliks rør installeret på specialbyggede manipulator eller på to af "arms "af en omvendt fleksible bærbare stativ (figur 1 og Supplerende Video 1). Vandet indåndes af undersøgelsen organisme opsamles ved omhyggeligt at placere den proksimale ende af et rør i eller nær den inhalant åbning af undersøgelsen organisme. Et identisk rør anbringes derpå inde i excurrent åbning. Denne operation kræver god pleje for at undgå kontakt eller forstyrrelse af dyret, fx ved sediment resuspension. til at begynde prøveudtagning en dykker gennemborer et septum i opsamlingsbeholderen med en sprøjte nål fastgjort til den distale ende af hvert rør, så det ydre vandtryk til at tvinge det samplede vand i fartøjet gennem prøverøret. sugningen initieres af vakuum tidligere oprettede i hætteglassene og af trykforskellen mellem den eksterne vand og den evakuerede prøvebeholderen .

For at sikre en ren samling af udåndet vand og undgå utilsigtet sugning af ambient vand ^16, skal holdes på et betydeligt lavere sats (<10%) end den excurrent flow vandet samplingfrekvens. Suget hastighed reguleres af længden af ​​røret og dets indre diameter (ID). Den lille indre diameter sikrer også en ubetydelig dødvolumen (<200 pi per meter slange). Udvælgelse over længere perioder (minutter til timer) gør det muligt at integrere den iboende patchiness af de fleste stoffer af interesse. At sikre, at prøverne er tilstrækkeligt bevaret i langvarige undersøiske prøveudtagningsrunder samt til transport til laboratoriet, en in situ filtrering anbefales til følsomme analytter. Udvælgelsen af ​​stikprøver fartøjer, filtrering montage og slanger er dikteret af undersøgelsens organismer og den specifikke problemstilling. Den nedenfor beskrevne protokol antager, at en fuld metaboliske profil er af interesse (for en oversigt se figur 2). Men den modulære natur af protokollen tillader f,eller let modifikation at rumme enklere eller endda meget forskellige prøveudtagningsordninger. For en fuld metaboliske profil, skal prøvetagningsprotokol omfatte følgende trin: (1) Flow visualisering; (2) Sampling ultra-plankton fodring (plankton <10 um); (3) Stikprøver uorganiske næringsstoffer optagelse og udskillelse (ved hjælp af in-line filtre); (4) Stikprøve opløst organisk optagelse og udskillelse (ved hjælp af in-line filtre); (5) Partikler fodring og udskillelse (ved hjælp af in-line filtre); (6) Gentag trin 2 (ultra-plankton fodring som kvalitetskontrol); (7) Flow visualisering.

Når logistisk muligt, anbefales det, at de metaboliske profilmålinger kombineres med pumpehastigheden (f.eks farvefronten hastighed fremgangsmåde, i ¹⁶⁾ samt med respiration målinger. Disse målinger bedst træffes i begyndelsen og slutningen af ​​prøvetagningen. For respirationsmåling, undersøiske optodes eller mikroorganismer elektroder er at foretrække.

Protocol

1. Forberedende Steps og rengøringsprocedurer renseopløsning Bær beskyttelsesudstyr, en lab coat, og handsker på alle tidspunkter. Udfør disse indledende skridt i en ren rum fri for støv og røg. Forbered en 5-10% saltsyre (HCI) løsning med frisk, høj kvalitet, dobbelt destilleret vand. Der fremstilles en 5% letopløseligt grundmix af anioniske og nonioniske overfladeaktive opløsning (se Materialer List) med frisk, høj kvalitet, dobbelt destillere…

Representative Results

Optimering af havvand indsamlingsmetoder Udvælgelse af opkøber hætteglas og rengøring procedure VacuSIP-kompatible indsamling fartøjer bør have en skillevæg, der tillader sampling at være indledt piercing med en sprøjte nål. De bør kunne modstå det forhøjede undervands tryk (2-3 bar ved typiske scuba arbejder d…

Discussion

Forberedende skridt

Samler hætteglas for DOM og næringsstofanalyser

Da collector fartøjer kan interagere med opløste mikro-vælgere og sampler vægge kan være et substrat for bakterievækst ^30-34, forskellige hætteglas for DOM og næringsstoffer samling blev testet. Borsilicat anbefales ikke til silica kvantificering ^33,35, idet glasflasker kan øge den initiale koncentration af silica med op …

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181