VacuSIP, усовершенствованный метод InEx<em> В Ситу</em> Измерение частиц примесей и растворенных веществ Обработанные Активные сестонофагов

Summary

We introduce the VacuSIP, a simple, non-intrusive, and reliable method for clean and accurate point sampling of water. The system was developed and evaluated for the simultaneous collection of the water inhaled and exhaled by benthic suspension feeders in situ, to cleanly measure removal and excretion of particulate and dissolved compounds.

Abstract

Benthic suspension feeders play essential roles in the functioning of marine ecosystems. By filtering large volumes of water, removing plankton and detritus, and excreting particulate and dissolved compounds, they serve as important agents for benthic-pelagic coupling. Accurately measuring the compounds removed and excreted by suspension feeders (such as sponges, ascidians, polychaetes, bivalves) is crucial for the study of their physiology, metabolism, and feeding ecology, and is fundamental to determine the ecological relevance of the nutrient fluxes mediated by these organisms. However, the assessment of the rate by which suspension feeders process particulate and dissolved compounds in nature is restricted by the limitations of the currently available methodologies. Our goal was to develop a simple, reliable, and non-intrusive method that would allow clean and controlled water sampling from a specific point, such as the excurrent aperture of benthic suspension feeders, in situ. Our method allows simultaneous sampling of inhaled and exhaled water of the studied organism by using minute tubes installed on a custom-built manipulator device and carefully positioned inside the exhalant orifice of the sampled organism. Piercing a septum on the collecting vessel with a syringe needle attached to the distal end of each tube allows the external pressure to slowly force the sampled water into the vessel through the sampling tube. The slow and controlled sampling rate allows integrating the inherent patchiness in the water while ensuring contamination free sampling. We provide recommendations for the most suitable filtering devices, collection vessel, and storing procedures for the analyses of different particulate and dissolved compounds. The VacuSIP system offers a reliable method for the quantification of undisturbed suspension feeder metabolism in natural conditions that is cheap and easy to learn and apply to assess the physiology and functional role of filter feeders in different ecosystems.

Introduction

Донные сестонофагов играют существенную роль в функционировании морских экосистем ^1. Путем фильтрации больших объемов воды ^2,3, они удаляют и выделяют в виде частиц (планктон и детрит) и растворенные соединения ¹ (и ссылки в них) и являются важным агентом бентического-пелагическая связи ^4,5 и круговорот питательных веществ ^6,7. Точного измерения частиц и растворенных веществ удаляются и выводятся из организма бентосными сестонофагов (например, губок, асцидий, полихет и двустворчатых) имеет фундаментальное значение для понимания их физиологии, обмена веществ и экологии питания. Вместе с накачкой измерения скорости, он также позволяет количественно оценить питательных потоков, опосредованных этими организмами и их экологического влияния на качество воды, а также на экосистемы масштабных процессов.

Выбор подходящего метода измерения скорости удаления и производства частиц и растворенный комфунтов по фильтраторов подвески имеет решающее значение для получения достоверных данных относительно их кормления деятельности ^8. Как отметил Riisgård и других, несоответствующих результатов методики смещения, искажают условия эксперимента, некорректными оценки приема и выделения определенных веществ, и может привести к ошибочному квантификации питательных потоков, обрабатываемых этими организмами.

Два наиболее часто используемые методы измерения частиц и растворенных потоков питательных веществ в фильтраторов включают либо инкубация (косвенные методы) или одновременный сбор окружающего воздуха и выдыхаемый воды (прямые методы). Методы инкубации основаны на измерении скорости изменения концентрации частиц и растворенных веществ в воде инкубированных и оценки темпов производства или удаления по сравнению с ⁸ надлежащих мер контроля. Тем не менее, приложив организм в инкубационной камере может изменить ее Feedinг и насосное поведение в связи с изменением режима естественного потока, из – за снижения кислорода и / или в концентрации пищи, или из – за накопления экскреции соединений в инкубационном воды ^7,9 (и ссылки в них). В дополнение к эффектам удержания и модифицированном водоснабжения, главным уклон методов инкубации происходит от повторной фильтрации эффектов (см, например , ^10). Хотя некоторые из этих методологических проблем были преодолены с помощью правильного объема и формы инкубационной емкости ¹¹ или с введением системы вакуумном колоколе , рециркулирующей в месте ^12, этот метод часто занижает скорость удаления и производства. Количественная метаболизм растворенных соединений , таких как растворенного органического азота (ДОН) и углерода (DOC) или неорганических питательных веществ, оказалась особенно склонны к пристрастий , вызванных методами инкубации ^13.

В конце 60-х и в начале 70-х годов, Генри Reiswig^9,14,15 пионером применения прямых методов количественной оценки удаления частиц гигантскими карибских губок, путем раздельного отбора проб воды , вдыхаемого и выдыхаемого организмов на месте. Из – за трудностей , чтобы применить технику Reiswig на меньших сестонофагов и в более сложных подводных условиях, большая часть исследований в этой области было ограничено лаборатории (in vitro) с использованием в основном косвенные методы ¹⁶ инкубации. Яэль и его коллеги переоборудованы Reiswig Прямые техники на месте , чтобы работать в менее масштабных условиях. Их метод, названный InEx ^16, основан на одновременном подводного отбора проб воды вдыхаемого (В) и выдыхаемого (Ex) от ненарушенных организмов. Различная концентрация вещества (например, бактерии) между парой образцов (INEX) дает меру удержания (или производства) этого вещества животным. Методика InEx использует открытые трубы иопирается на выводной струи одной насосной активности исследуемого организма пассивно заменить окружающую воду в сборном трубке. В то время как Яэль и его коллеги успешно применили эту технику при изучении более чем 15 различных сестонофагов таксонов (например, ^17), метод сдерживается высоким уровнем практики и опыта , необходимых, по крохотной размер некоторых выводящий отверстий, и морские условия.

Чтобы преодолеть эти препятствия, мы разработали альтернативный метод, основанный на контролируемом отсоса отобранного воды через минуту трубок (наружным диаметром <1,6 мм). Наша цель состояла в том, чтобы создать простую, надежную и недорогое устройство , которое позволило бы чистой и контролируемой на месте отбора проб воды в с очень конкретной точки, такие как вытекающий отверстие донными сестонофагов. Чтобы быть эффективным, этот метод должен быть ненавязчивым, чтобы не повлиять на режим окружающего потока или изменить бehavior изученных организмов. Устройство, представленное здесь, называется VacuSIP. Это упрощение системы SIP , разработанного Yahel и др. (2007) ¹⁸ для точки отбора проб ROV основе в глубоком море. VacuSIP значительно дешевле, чем оригинальный SIP и он был адаптирован для SCUBA на основе работы. Система была разработана в соответствии с принципами , изложенными и испытываются Райтом и Stephens (1978) ¹⁹ и Møhlenberg и Riisgård (1978) ²⁰ для лабораторных установок.

Хотя система VacuSIP была разработана для исследований натурных метаболизма донными сестонофагов в, он также может быть использован для лабораторных исследований и там , где требуется контролировать и чистый, отбираемой воды из точечных источников. Эта система особенно полезна , когда требуется интеграция в течение продолжительного периода (мин-часов) или в фильтраций на места. VacuSIP был успешно использован в лаборатории Yahel с 2011 года, а также имеетбыли использованы в двух недавних исследованиях питательных потоков , опосредованных карибских и средиземноморских видов губок ²¹ (Morganti и др. представили).

Использование конкретных пробников, продолжительность отбора проб длительной и полевых условиях, в которых применяется VacuSIP, влекут за собой некоторые отклонения от стандартных океанографических протоколов для сбора, фильтрации и хранения образцов для чувствительных аналитов. Для того, чтобы снизить риск заражения системы VacuSIP или риск модификации отобранного воды за счет бактериальной активности после сбора, мы тестировали различные в точке процедур фильтрации и хранения. Различные фильтрующие устройства, сбор судов, а также процедуры хранения были рассмотрены с целью достижения наиболее подходящей методики для анализа растворенного неорганического (PO ₄ ^3-, NO _х ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ и органических (DOC + DON) соединения и ультра-планктон (<1081; м) и твердых органических (ПСУ + выборки PON). Для дальнейшего снижения риска загрязнения, особенно в полевых условиях, число шагов обработки было сведено к минимуму. Визуальный формат, в котором представлен способ ориентирован, чтобы облегчить воспроизводимости и сократить время, необходимое для эффективного применения метода.

Системный Обзор

Для образца на месте закачивают воду из сестонофагов с exhalant отверстиями размером до 2 мм в насосную активность каждого образца вначале визуализируются, освободив фильтруется флуоресцеина окрашенные морской воды рядом с летучими отверстием (ами) и наблюдая за его потока из выводной апертуры ¹⁶ (см также рис 2B в ^18). Вода вдохнул и выдыхаемым исследование образца (incurrent и вытекающий) затем одновременно оцифровываются с использованием пары минутных трубок, установленных на заказного манипулятором или на двух из "армс "перевернутого вниз гибкий переносной штатив (рисунок 1 и дополнительного видео 1). Вода вдыхается исследуемого организма собирают путем тщательного позиционирования проксимальный конец одной трубы внутри или вблизи летучими апертуры исследуемого организма. Идентичный затем труба расположена внутри выводной отверстия. Эта операция требует хорошего ухода , чтобы избежать контакта или помех животного, например, осадком взмучивания. чтобы начать отбор проб, водолаз прокалывает перегородку в накопительную емкость с иглой шприца , прикрепленной к дистальный конец каждой трубки, что позволяет внешнему давлению воды, чтобы заставить отобранной воды в емкость через пробоотборную трубку. всасывающий инициируется с помощью вакуума предварительно созданного в ампулах и по разности давлений между внешней водой и эвакуированной контейнер для образца ,

Для того, чтобы обеспечить чистую коллекцию выдыхаемого воды и во избежание случайного всасывания AMBIлор воды ^16, частота дискретизации вода должна храниться при значительно более низкой скорости (<10%) , чем скорость потока выводной. Скорость всасывания регулируется по длине трубы и ее внутренним диаметром (ID). Небольшой внутренний диаметр также обеспечивает незначительный мертвый объем (<200 мкл на метр трубы). Отбор проб в течение длительных периодов (от минут до часов) позволяет интегрировать присущую мозаичности большинства веществ, представляющих интерес. Для того, чтобы гарантировать , что образцы должным образом сохраняется при длительных подводных сеансов отбора проб, а также для транспортировки в лабораторию, фильтрации на месте в рекомендуется для чувствительных аналитов. Выбор сосудов для отбора проб, сборка фильтрации и трубы продиктованы исследования организмов и конкретного вопроса исследования. Протокол , описанный ниже , предполагает , что полный метаболическим профилем представляет интерес (для получения дополнительной информации смотрите Рисунок 2). Тем не менее, модульный характер протокола позволяет пили простой модификации, чтобы приспособить более простые или даже очень разные схемы отбора проб. Для полного метаболического профиля, протокол выборки должен включать в себя следующие шаги: (1) Визуализация потока; (2) подачи проб ультра-планктона (планктон <10 мкм); (3) Отбор проб неорганический поглощение питательных веществ и выведению (с использованием проходных фильтров); (4) Отбор проб растворенного органического поглощения и выведения (с использованием проходных фильтров); (5) Твердые частицы кормления и экскреции (с использованием проходных фильтров); (6) Повторите шаг 2 (ультра-планктона кормление как проверка качества); (7) потока визуализации.

Когда это возможно материально – технического обеспечения, то рекомендуется , что метаболические измерения профилей в сочетании с накачкой скорость (например, метод спереди красителя скорость, в ^16), а также с результатами измерений дыхания. Эти измерения лучше всего принимать в начале и в конце сеанса выборки. Для измерения дыхания, подводные optodes или микро-электроды являются предпочтительными.

Protocol

1. Подготовительные шаги и очистительные процедуры очищающий раствор Носите защитную одежду, пальто лаборатории и перчатки во все времена. Выполните эти подготовительные шаги в чистом пространстве, свободной от пыли и дыма. Приготовьте раствор 5-10% соляной …

Representative Results

Оптимизация методов сбора морской воды Выбор коллектора флаконов и процедуры очистки VacuSIP-совместимые коллекторные емкости должны иметь перегородку, которая позволяет выборо?…

Discussion

Подготовительные шаги

Коллектор Флаконы для DOM и анализа питательных веществ

Поскольку коллектор суда могут взаимодействовать с растворенными в микро-составляющих и сэмплера стенки могут быть субстратом для бактерий роста ^30-34…

Materials

GorillaPod, Original	Joby	GP000001	flexible portable tripod
Flangeless Ferrule	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" in Blue/pk
Male Nut	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" in Green/10pk
Female to Female Luer	IDEX Health & Science	P-658
Female-Male Luer	IDEX Health & Science	P-655
Peek Tubing (250µm ID)	IDEX Health & Science	1531	1/16" OD x 0.01in ID x 5ft lenght. Alternative ID can be used
Two component resin epoxy	IVEGOR	9257	Mix well the two component resin before use
(TOC) EPA VIALS	Cole -Parmer	03756-20	40 ml glass vials. Manifactured also by Thomas Scientific (ref. number 9711F09)
HDPE VIALS	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml high-density polyethylene vials
Vacuette Z no additive	Greiner bio-one	455001	pre-vacuum by the manufacturer
Septum Sample Bottles	Thomas Scientific	1755C01	250 ml glass bottles
Septum Cap 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 for HDPE vials
Septum Cap 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 for glass vials and bottles. Also manufactured by Thermo Scientific National (ref. 03-377-42)
In-line stainless steel Swinney Filter holders	Pall	516-9067	13mm of diameter
PTFE Seal Washer	Pall	516-8064	ring for stainless steel filter holders
TCLP Glass Filters	Pall	516-9126	binder-free glass fiber filters, 13mm of diameter,  pore size 0.7µm
Polycarbonate Filter Holders	Cole -Parmer	17295	13mm of diameter
Isopore Membrane Filters	Millipore	GTTP01300	13mm of diameter, pore size 0.2 µm
Contrad 2000 Solution	Decon Labs	E123FH	highly soluble basic mix of anionic and non-ionic surfactant solution
Sterile Syringe Filters	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	25mm of diameter , pore size 0.2 µm
Fluorescein	Sigma-Aldrich	(old ref.28802) 46955-100G	100g
Holdex, disposable,sterile	Greiner bio-one	450263	sterile, single-use tube holder with off-center luer for Vacuette
Sterile Needles	IcoGammaPlus	5160	0.7mm x 30mm
Cryovials Nalgene	Nalgene	V5007(Cat. No.5000-0020)	2ml
Cryobox carton	Rubilabor	M-600	145x145x55mm p/microtube 1.5 ml
Orthophosphoric Acid	Sigma	79617
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	500g
Glutaraldehyde	Merck	8,206,031,000	25%, 1 L
Hand Vacuum Pump	Bürkle	5620-2181