Tekniker för evolutionen av Robust pentosjäsande jäsa Jäst för bioomvandlingen av Lignocellulosa till etanol
Summary
Adaptiva evolution och isoleringstekniker beskrivs och demonstreras för att ge derivat av Scheffersomyces stipitis stam NRRL Y-7124 som är i stånd att snabbt förbruka hexos och pentos- blandade socker i enzym försockrad undetoxified hydrolysat och ackumulera över 40 g / L etanol.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
Uppskattningsvis årliga 1,3 miljarder torra ton lignocellulosa kan stödja etanolproduktionen och göra det möjligt för oss att minska sin oljeförbrukning med 30%. 1 Även växtbiomassa hydrolys ger sockerblandningar rika på glukos och xylos, är fermentationshämmare som genereras av kemisk förbehandling nödvändig att bryta ned hemicellulosa och exponerar cellulosa för enzymatisk attack. Ättiksyra, furfural och hydroximetylfurfural (HMF) tros vara viktiga komponenter bland många hämmare som bildas under förbehandlingen. För att flytta lignocellulosa etanolindustrin framåt, forskning och förfaranden tillåta utvecklingen av jäststammar med förmåga att överleva och effektivt fungerande använda både hexos och pentossocker i närvaro av sådana hämmande föreningar behövs. En betydande ytterligare svaghet traditionella industrijäststammar, såsom Saccharomyces cerevisiae, är oförmågan att effektivt ferment är xylos finns i hydrolysat av växtbiomassa.
Pichia stipitis typstammen NRRL Y-7124 (CBS 5773), nyligen omdöpt Scheffersomyces stipitis, är en infödd pentos jäsande jäst som är väl känd för att jäsa xylos till etanol. 2,3 Utvecklingen av stammen NRRL Y-7124 fortsatte här eftersom det har dokumenterats till har den största potentialen av inhemska jäststammar att samla ekonomiskt utvinnings etanol som överstiger 40 g / L med liten xylitol biprodukt. 4,5,6 i optimal media, S. stipitis-stammen NRRL Y-7124 producerar 70 g / L etanol i 40 h (1,75 g / l / tim) vid ett utbyte av 0,41 ± 0,06 g / g i hög celltäthet kulturer (6 g / L-celler). 7,8 Motstånd till fermentationshämmare etanol, furfural, och HMF har också rapporterats, 9 och S. stipitis har varit rankad bland de mest lovande infödda pentosjäsande jästar tillgängliga för kommersiell skala etanol production från lignocellulosa. 10 Vårt mål var att tillämpa olika undetoxified lignocellulosa hydrolysat och urvals etanol tryck för att tvinga utvecklingen mot en mer robust derivat av stammen NRRL Y-7124 lämpar sig för industriella applikationer. Key bland förbättrade funktioner söks var snabbare sockerupptagshastigheter i koncentrerade hydrolysat, minskad diauxy för effektivare blandad sockerutnyttjande och högre toleranser etanol och hämmare. Tillämpningen av S. stipitis till undetoxified hydrolysat var en central fråga i forskningen för att eliminera den extra rörelsekostnader i samband med hydrolysat avgiftningsprocesser, såsom overliming.
Två industriellt lovande hydrolysaten tillämpades för att tvinga evolution. Enzym sackarifierad ammoniak fiber expansionen förbehandlat majs Stover hydrolysat (AFEX CSH) och utspädd syra förbehandlat switch hydrolysat sprit (PSGHL) 11,12 AFEX förbehandlingstekniken utvecklas tillminimera produktionen av jäsningshämmare, medan utspädd syra förbehandling representerar den aktuella lägsta kostnad teknik oftast praktiseras att utsätta cellulosa biomassa för enzymatisk försockring. PSGHL kan skiljas från cellulosan som återstår efter förbehandling och är karakteristiskt rik på xylos från den hydrolyserade hemicellulosa, men låg i glukos. AFEX CSH och PSGHL kompositioner skiljer sig från varandra i viktiga aspekter som utnyttjas för att hantera utvecklingen processen. AFEX CSH är lägre i furan aldehyder och ättiksyra inhibitorer men högre på aminosyror och ammoniak kvävekällor jämfört med PSGHL (tabell 1). PSGHL presenterar ytterligare en utmaning av xylos är den dominerande socker till förfogande. PSGHL är därför lämpligt att specifikt anrika förbättrad xylosanvändning i hydrolysat, en svaghet förhindrar kommersiell användning av tillgängliga jäst. Även bland infödda pentos jäsande jäst, beroendet på suboptimal socker xyloSE för att stödja celltillväxt och reparation blir ännu svårare i hydrolysat på grund av en rad olika skäl:. näringsbrister, hämmare orsakar omfattande skador på cell strukturell integritet, och störningar i ämnesomsättningen på grund av redox obalanser 9 Kväve tillskott, särskilt i form av aminosyror, kan utgöra en betydande driftskostnad för fermentationer. Effekten av kväve tillskott på isolat screening och ranking undersöktes med switch hydrolysat.
Förbättrade personer anrikades i en föränderlig befolkningen som använder flera selektionstryck beroende på naturlig genetisk mångfald S. stipitis befolkning och mutationer som induceras av exponering för två olika hydrolysat, etanol eller UV-strålning. Selektionstryck anbringades parallellt och i serie för att undersöka utvecklingen utvecklingen av S. stipitis mot önskade derivat som kan växa och jäsa effektivt i hydrolysat(Figur 1). Den repetitiva odling av funktionella populationer i allt mer utmanande hydrolysat åstadkoms på mikroplattor med användning av en utspädningsserie av antingen 12% glukan AFEX CSH annars PGSHL ställdes vid 20% torrhalt. Tillämpningen av etanol-utmanade tillväxt på xylos i kontinuerlig kultur förbättras ytterligare AFEX CSH anpassade populationer genom att berika för fenotyper som visar mindre känslighet för etanol förtryck av xylosanvändning. Den sistnämnda funktionen visades nyligen problematiskt att pentos utnyttjande av stammen NRRL Y-7124 efter glukosfermentering. 8 Anrikning på PSGHL var nästa undersökas för att bredda hydrolysat funktionalitet.
Förmodade förbättrade derivat av S. stipitis NRRL Y-7124 isolerades från varje fas av utvecklingen processen med hjälp av riktade anrikning under stressförhållanden och utspädningsplatt att plocka kolonier från de vanligaste populationer. dimensionslös relativaprestandaindex (RPIs) användes för att rangordna stammar baserade på prestanda, där kinetisk beteende utvärderades på olika hydrolysat typer och näringstillskott tillämpas. Även om framgångarna för olika förfaranden anpassning för att förbättra funktionaliteten hos S. stipitis i lignocellulosa hydrolysat har tidigare dokumenterats, stammar visar ekonomisk etanolproduktion på undetoxified hydrolysat har inte tidigare rapporterats. 13-17 Använda evolution förfaranden som skall visualiseras i mer detalj här, Slininger et al. 18 utvecklade stammar som avsevärt förbättras under moderstammen NRRL Y-7124 och kan producera> 40 g / L etanol i AFEX CSH och enzym sackarifierad switch hydrolysat (SGH) lämpligt kompletteras med kvävekällor. Dessa nya stammar av framtida intresse för att utveckla lignocellulosa till etanolindustrin och som föremål för ytterligare genomik studier byggnadpå de tidigare sekvense stam NRRL Y-11545. 19 A genomik studie av bästa stammar som producerats under olika faser av utveckling i diagramform i figur 1 skulle belysa historien om genetiska förändringar som skett under utveckling som en upptakt till ytterligare stam förbättring forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera steg var kritiska för framgången av utvecklingen processen. Det första är det för att välja lämpliga selektionstryck för att driva befolkningen utveckling mot de önskade fenotyper som behövs för framgångsrik tillämpning. Följande selektiva spänningar valdes för S. stipitis utveckling och tillämpad vid lämpliga tidpunkter för att vägleda anrikning för de önskade fenotyper: ökande styrkor av 12% glukan AFEX CSH (vilket tvingar tillväxt och fermentering av olika sockerarter i närvaro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader’s Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
