نحن هنا شرح بروتوكول لنمذجة المكروية الفيزيائية الحيوية حيث يشابك وزيادة تصلب الغشاء القاعدي (BM) الناجم عن endproducts غلكأيشن المتقدم (أجس) له أهمية المرضية.
نحن هنا وصف بروتوكول التي يمكن استخدامها لدراسة المكروية الفيزيائية الحيوية ذات الصلة إلى زيادة سماكة وتصلب الغشاء القاعدي (BM) خلال الأمراض المرتبطة بالعمر واضطرابات التمثيل الغذائي (مثل السرطان والسكري وأمراض الاوعية الدموية الدقيقة، واعتلال الشبكية، اعتلال الكلية والاعتلال العصبي) . فرضية من هذا النموذج هو يشابك غير الأنزيمية من BM (RBM) المصفوفة التي أعيد تنظيمها العلاج مع glycolaldehyde (GLA) لتعزيز المتقدمة غلكأيشن endproduct (AGE) جيل عن طريق تفاعل ميلارد. تعامل أمثلة من التقنيات المخبرية التي يمكن استخدامها لتأكيد جيل AGE، يشابك غير الأنزيمية وزيادة صلابة في GLA ترد الإدارة القائمة على النتائج. وتشمل هذه إعداد الإدارة القائمة على النتائج الأم (تعامل مع الفوسفات مخزنة المالحة، PBS) وتصلب الإدارة القائمة على النتائج (تعامل مع GLA) لتحديد ما يلي: محتوى AGE من خلال تحليل الضوئية والفحص المجهري مناعي، يشابك غير الأنزيمية من قبل الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميدالكهربائي للهلام (SDS PAGE)، وكذلك الفحص المجهري متحد البؤر، وفي زيادة صلابة باستخدام rheometry. الإجراء الموضح هنا يمكن أن تستخدم لزيادة صلابة (الرجوعية المرنة، E) الإدارة القائمة على النتائج تصل إلى 3.2 أضعاف، بما يتفق مع القياسات التي أجريت في الاصحاء المريضة أنسجة البروستاتا البشرية. لإعادة المكروية الفيزيائية الحيوية المرتبطة بالشيخوخة والبروستات غدة المريضة أدخلت ثلاثة أنواع خلايا البروستاتا إلى الإدارة القائمة على النتائج المحلية وتصلب الإدارة القائمة على النتائج: RWPE-1، الخلايا الظهارية البروستاتا (المتوقَّع (PECs)) المشتقة من غدة البروستاتا الطبيعية. BPH-1، المتوقَّع (PECs) المستمدة من غدة البروستاتا تتأثر تضخم البروستاتا الحميد (BPH). وPC3، الخلايا المتنقل المستمدة من سرطان العظم الثانوي القادمة من سرطان البروستاتا. ويمكن قياس معلمات متعددة، بما في ذلك حجم وشكل وخصائص الغازية من عنيبات غدي 3D التي شكلتها RWPE-1 و BPH-1 على مواطن مقابل تصلب الإدارة القائمة على النتائج، ومتوسط طول الخلية، وسرعة المهاجرة واستمرار حركة الخلية من spher 3Dالكويكبات التي شكلتها خلايا PC3 تحت نفس الظروف. خلية مسارات الإشارات وتوطين التحت خلوية من البروتينات يمكن أيضا تقييم.
The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma1. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices2. These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components1. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia3.
During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes5. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).
The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels6 was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland7; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH8; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient9.
In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.
تم تعديل بروتوكول لتوليد 3D عنيبات غدي من MECs في المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج نقية 6 في دراسة سابقة بإضافة 4 ملغ نوع / مل أنا الكولاجين لمصفوفة الإدارة القائمة على النتائج. أدت إضافة الكولاجين في معامل مرونة من هلام الإدارة القائمة على النتائج زيادة من 175 ± 37-1589 ± 380 الضغط بمقياس الباسكال. هذه الزيادة 9.1 أضعاف في صلابة التضمين النمو والبقاء والهجرة وتمايز MECs 21. تم تعديل بروتوكول مرة أخرى بما في ذلك خطوة العلاج مع د – (-) – الريبوز لتعزيز يشابك غير الأنزيمية من الكولاجين النوع الأول التي أضيفت إلى هلام الإدارة القائمة على النتائج. تم العثور الناتجة من زيادة 15 ضعفا في صلابة للتعاون مع التحول أنكجنيك من MECs لتعزيز السلوك الغازية 22. المنهج التجريبي إضافة النوع الأول الكولاجين إلى المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج يسهل التفاعل المباشر من MECs مع ألياف الكولاجين، والذي يحدث فقط في الأنسجة البشرية بعد حاجز مادي بين سدىوظهارة التي تقدمها BM يخضع تدهور بروتين. عن طريق توليد عنيبات غدي 3D من المتوقَّع (PECs) في المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج نقية قبل المعاملة مع GLA، البروتوكول الحالي يفتح الطريق لدراسة كيفية BM صلابة في حد ذاتها يمكن أن تؤدي إلى السلوك الغازية (الشكل 3). مستويات BM صلابة يتسبب في هذا البروتوكول لها أهمية فسيولوجية. الحضانة مع 50 ملي تأجير لمدة 6 ساعة و 14 ساعة على التوالي زاد الرجوعية المرنة للهلام الإدارة القائمة على النتائج النقي إلى 175 ± 90 و 322 ± 160 مقارنة ب 122 ± 55 الضغط بمقياس الباسكال في الهلام الإدارة القائمة على النتائج تعامل مع برنامج تلفزيوني (الجدول 1). هذه الزيادة 1،7-3،2 أضعاف في الإدارة القائمة على النتائج صلابة يلخص 2.5- إلى 3.4 أضعاف زيادة في صلابة لوحظ في خبيث مقارنة البروستاتا الطبيعية أو الأنسجة BPH 23-26. كما هو مبين في منشور صدر مؤخرا 13 التغييرات الشكلية الناجمة عن تراكم AGE والإدارة القائمة على النتائج صلابة في PEC عنيبات يمكن قياسها كميا لتحول كبير إحصائيا من عounded إلى شكل متعدد الأضلاع، وانخفاض اللمعية / المساحة الكلية عنيبية، وجاحظ الخلايا المهاجرة من acina في سن الغنية الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 3). ويمكن أيضا Immunoblotting استخدامها لتقييم علامات EMT (مثل فقدان E-كادهيرين 13) وسلوك مقلص (على سبيل المثال فسفرته ضوء الميوسين سلسلة 2، pMLC2 13) في بيكس نمت في وضعها الطبيعي مقابل تصلب الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 3). مزيد من التقييم باستخدام تلوين مناعي والفحص المجهري متحد البؤر يمكن تطبيقها على تصور BM (مثل laminin، الكولاجين الرابع وتراكم AGE 13)، الخلوية قمي إلى القاعدية القطبية (على سبيل المثال توطين القمي EEA1: بداية endosomal مستضد 1؛ وGM130: 130 كيلو دالتون رابطة الدول المستقلة جولجي علامة 13) والأنماط الخلوية من جزيئات الالتصاق (على سبيل المثال كادهيرين E التوطين إلى تقاطعات خلية خلية 13) (الشكل 3).
<img alt = "الشكل 3" src = "/ ملفات / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg" />
الشكل (3): لمحة عامة عن البروتوكولات المختلفة المقدمة هنا يصور الرسم كيفية إعداد وتصلب الغشاء القاعدي المعاد (RBM) مع glycolaldehyde (تفاعل ميلارد)، وكيفية البذور الخلايا إلى الإدارة القائمة على النتائج قاسية، وكيفية تحليل الإدارة القائمة على النتائج شديدة ( مدى تفاعل ميلارد) والإجراءات التي يمكن استخدامها لتحليل التغيرات الخلوية والجزيئية الناجمة عن الإدارة القائمة على النتائج-AGE الغنية. AGE، endproducts غلكأيشن المتقدم؛ BM، الغشاء القاعدي. دابي، 4، 6 diamidino-2-phenylindole. EEA1، في وقت مبكر مستضد endosomal 1؛ GAPDH، غليسيرألدهيد-3-فوسفات نازعة. GLA، glycolaldehyde. جي، جليكاين إيثيل استر، GM130، 130 كيلو دالتون رابطة الدول المستقلة جولجي علامة. ف MLC2 (Thr18 / Ser19)، الميوسين ضوء سلسلة 2 فسفرته في مواقع ثريونين 18 و سيرين 19. الإدارة القائمة على النتائج، الغشاء القاعدي المعاد. SDS-PAGE، كبريتات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد الكهربائي. للحصول على شريط RWPE1 عنيبات مقياس = 10 ميكرون. لالخلايا السرطانية PC3شريط الكروية مقياس = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 13. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
سوف خطوات حل المشاكل يكون ضروريا إذا D – يتم اختيار الريبوز وكيلا يشابك الإدارة القائمة على النتائج – (-). خلال تطوير بروتوكول وجد أن المعاملة مع 1 M D – (-) – الريبوز لمدة 72 ساعة، كما هو موضح سابقا عن المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج / الكولاجين 22، أسفر عن الجفاف وانكماش المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج. تقييم تركيزات أقل من D – (-) – الريبوز والأوقات العلاج أقصر قد تساعد في التغلب على هذا القيد.
يمكن أن تصادف وجود قيود محتملة في التطبيقات المستقبلية للبروتوكول حيث المطلوب مستويات أعلى من الإدارة القائمة على النتائج صلابة. إذا تم استخدامها مرات حضانة أطول وتركيزات أعلى من GLA للحث على مستويات أعلى من الإدارة القائمة على النتائج هلام صلابة سيكون من الضروري ل تقييم ما إذا كانت هذه الشروط معاملة لها تأثير على بقاء الخلية والانتشار، كما هو موضح سابقا (13). كما تجدر الإشارة إلى أن حضانة RWPE-1 الخلايا مع المصل يؤدي الى مثل EMT التحول المظهري والتعرض لمصل أو المواد المحتوية على مصل ينبغي تجنبها. على سبيل المثال، إذا تنطوي على تجارب ترنسفكأيشن بالتدخل قصيرة الحمض النووي الريبي (سيرنا) [أليغنوكليوتيد، ينبغي أن يكون الأمثل الإجراء باستخدام خلايا RWPE-1 نمت في KSFM، دون تبديل الخلايا إلى انخفاض وسائل الإعلام ترنسفكأيشن المصل. هذا العيب يمكن أن يقلل من مستوى الجينات إسكات يتحقق عند استخدام سيرنا عابرة النهج في النموذج. لبعض الأهداف البروتين فإنه ينصح لتوظيف ناقلات shRNA محرض لإسكات الجينات الانضباطي وانخفاض المطلوب في مستويات البروتين. ويمكن أيضا أن تدمج التعديلات التي تتضمن يشابك الأنزيمي خلية اللحمية أو الخلايا السرطانية الليزيل المرتبطة أوكسيديز (لوكس) 17 في نماذج المستقبل.
jove_content "> وهذا البروتوكول تسهيل الدراسة المستقبلية للآليات الموالية الغازية الناجمة عن تعتمد على العمر BM صلابة في بيكس (RWPE-1، BPH-1) وتقييم أهداف مكافحة المنتشر في PTCs الغازية (PC3). وبالنظر إلى أن BPH يعتبر اضطراب التمثيل الغذائي 27، هذا البروتوكول يمهد الطريق أيضا نحو لدينا فهم أفضل للعلاقة بين الاضطرابات الأيضية وزيادة خطر الاصابة بسرطان البروستاتا. وبالنظر إلى أن BM صلابة الناجم عن التعرض لأجس قد تكون نقطة انطلاق لغزو في السرطان الأخرى أنواع، وسوف تكون ذات فائدة لاستخدام بروتوكول لانشاء نماذج مماثلة التي تتضمن الخلايا الظهارية الطبيعية والخلايا السرطانية من الأجهزة الأخرى (مثل الثدي والقولون والمبيض والبنكرياس).وتتلخص الخطوات الحاسمة في البروتوكول، جنبا إلى جنب مع توقيتها، في الشكل (4). وخلال الخطوة الأولى من الضروري للحفاظ على حل سهم الإدارة القائمة على النتائج في 4 درجات مئوية في حين أنه يذوب لمنع بول لymerization. لا ينبغي أن توضع نصائح ماصة في حل الأسهم RM حتى وتأثرت إلى 4 درجات مئوية. للخطوة التالية من المهم أيضا لضمان والمتوازنة الشرائح غرفة إلى 4 درجة مئوية قبل والمغلفة هم مع الحل الإدارة القائمة على النتائج. حالما يتم زيادة درجة حرارة المحلول الإدارة القائمة على النتائج فوق 4 درجات مئوية فإنه سيخضع البلمرة لا رجعة فيها لتشكيل مادة هلامية. من الضروري أن الإدارة القائمة على النتائج غير منزعجة خلال المرحلة البلمرة لضمان أن تشكل حتى السطح مناسبة لزراعة الخلايا والتحليل المجهري. ومدة الحضانة مع GLA مع أو بدون مثبطات للتفاعل ميلارد (سيان بورهيدريد الصوديوم وamingoguanidine) تحديد كيفية قاسية يصبح جل الإدارة القائمة على النتائج. فمن المستحسن استخدام حضانة 6 ساعات مع GLA إذا كانت هناك حاجة ظروف شبه صلبة، والحضانة 14 ساعة إذا كانت هناك حاجة ظروف قاسية (الجدول 1). حضانة مرات بديلة أو تركيزات GLA يمكن أن تستخدم إذا كانت مستويات مختلفةمن صلابة والمطلوب. في هذا التحليل حالة الانسيابية من المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج بحاجة إلى أن تدرج كخطوة أساسية. بعد خطوة من التبريد للتفاعل ميلارد من الحضانة مع جي والخطوات اللاحقة الغسيل مع برنامج تلفزيوني، والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج يمكن استخدامها على الفور أو تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل استخدامها للثقافة الخلية. مرة واحدة يتم تعيين مزارع الخلايا تصل من المهم تغيير ثقافة المتوسط (بما في ذلك أي علاج) كل يومين. فمن المستحسن للحفاظ على مزارع الخلايا 3D ل3-12 أيام وفقا لمعايير قيد التحقيق. ل3D عنيبات PEC فمن المستحسن لتحليل الثقافات بعد 6 أيام، ول3D المؤسسة العامة للاتصالات الكروية تحليل ينصح بعد 3 أيام من الثقافة في المقام الأول.
الشكل (4): نظرة عامة بسيطة من بروتوكول مع خطوات الهامة والتوقيت وأشارت فلوالرسم البياني ث يصور كيفية إعداد وتشديد الطابق السفلي غشاء المعاد (RBM) مع glycolaldehyde (مايار رد فعل) مع الخطوات الحاسمة ومواعيد المشار إليها. نقاط حيث البروتوكول يمكن وقفها، والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج تخزين، وأشار أيضا. الإدارة القائمة على النتائج، الغشاء القاعدي المعاد. GLA، glycolaldehyde. جي، جليكاين إيثيل استر، ON، بين عشية وضحاها. برنامج تلفزيوني، مخزنة فوسفات المالحة. RT، درجة حرارة الغرفة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
The authors have nothing to disclose.
We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.
I – Material for monolayer culture | |||
BPH-1 | CaP Cell Line Database | PCaCL-132 | Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu |
Complete keratinocyte serum-free media | ThermoFisher Scientific | 17005-075 | Do not warm at 37 ºC before use |
Fetal calf serum | First Link UK Ltd | 02-00-850 | Store at -20 ºC in aliquots |
PC3 | American Type Culture Collection | CRL-1435 | |
Penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15070-063 | |
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets | Oxoid | BR0014G | |
RPMI 1640 medium | Sigma-Aldrich | R5886 | warm in 37 ºC water bath before use |
RWPE-1 | American Type Culture Collection | CRL-11609 | |
Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
II – Material for 3D culture | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | |
Aminoguanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 396494 | Irritating to eyes, respiratory system and skin |
Chamber slides, 8-well | Thermo Scientific Nunc Lab-Tek | TKT-210-816M | |
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract | AMS Biotechnology | 3445-005-01 | Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots |
Cyanogen bromide | Sigma-Aldrich | C91492 | Toxic by contact skin and inhalation |
Formic acid | Sigma-Aldrich | 695076 | |
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE) | Sigma-Aldrich | 50060 | Irritating to eyes |
Glycolaldehyde dimer (GLA) | Sigma-Aldrich | G6805 | |
Sodium cyanoborohydride | Sigma-Aldrich | 71435 | Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation |
Syringe filter 0.22 microns | Appleton Woods | BC680 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
III – Material to quantify Maillard reaction | |||
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | ThemoFisher Scientific | D3571 | light sensitive and store at -20 ºC in aliquots |
Cloning cylinders | Sigma-Aldrich | C1059 | |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11001 | light sensitive |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | ThemoFisher Scientific | A-11034 | light sensitive |
Goat serum | Abcam | ab7481 | Store at -20 ºC in aliquots |
Vectashield mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | |
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb | TransGenic Inc | KH012 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | F8775 | Store at -20 ºC in aliquots |
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody | Acris Antibodies | R1041 | Store at -20 ºC in aliquots |
Rabbit anti-laminin A/C pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc | sc-7292 | Store at -20 ºC in aliquots |
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100) | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20) | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer | ThemoFisher Scientific | 66333 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
IV – Equipment | |||
ARG2 controlled strain rotational rheometer | T.A. Instruments | ||
Axiovert S100 (20x magnification) microscope | Zeiss | ||
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope | Solent Scientific | ||
Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope | Zeiss | ||
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast | Olympus | ||
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer | BMG Labtech | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
V – Software | |||
Image J 1.47v | National Institute of Health, USA | ||
MetaXpress | Molecular Divices |