This paper presents a sensitive method called Circle-Seq for purifying extrachromosomal circular DNA (eccDNA). The method encompasses column purification, removal of remaining linear chromosomal DNA, rolling-circle amplification and high-throughput sequencing. Circle-Seq is applicable to genome-scale screening of eukaryotic eccDNA and studying genome instability and copy-number variation.
Ekstrakromosomale sirkulære DNA-molekyler (eccDNAs) er vanlige genetiske elementer i Saccharomyces cerevisiae, og er rapportert i andre eukaryoter også. EccDNAs bidra til genetisk variasjon blant somatiske celler i flercellede organismer og til utviklingen av encellede eukaryoter. Følsomme metoder for å påvise eccDNA er nødvendig for å avklare hvordan disse elementene påvirker genom stabilitet og hvordan miljømessige og biologiske faktorer indusere dannelsen i eukaryote celler. Denne videoen presenterer en følsom eccDNA-rensing metode kalt Circle-sekv. Metoden omfatter kolonne rensing av sirkulært DNA, fjerning av gjenværende lineær kromosomalt DNA, rullende sirkel forsterkning av eccDNA, dyp sekvensering, og kartlegging. Omfattende eksonuklease-behandling var nødvendig for tilstrekkelig lineær kromosomalt DNA degradering. Den rullende sirkel forsterkning stegine-høyde. normal; "> φ 29 polymerase beriket for sirkulært DNA i løpet av lineære DNA Validering av Circle-Seq metoden på tre S. cerevisiae CEN.PK populasjoner av 10 10 celler oppdaget hundrevis av eccDNA profiler i størrelser større enn 1 kilobase . Gjentatte funn av ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 gener på sirkulært DNA i både S288C og CEN.PK antyder at DNA circularization er konservert mellom stammene ved disse loci. i sum har Circle-Seq metode bred anvendelse for genom-skala screening for eccDNA i eukaryoter så vel som for detektering av spesifikke eccDNA typer.
Oppdager tidlig eller forbigående kromosom forsterkning er vanskelig fordi det krever å identifisere endringer i enkelt DNA-molekyler i store populasjoner av celler. Kromosomkopinummervariasjoner (CNVs) er vanligvis oppdaget godt etter sin etablering, slik at bare den endelige CNV struktur som bevis av mekanismen som genererte variasjon 1,2. Oppdager og utvinne ekstrakromosomalt sirkulært DNA (eccDNA) i tidligere stadier av CNV dannelse kan belyse pågående prosesser i genomisk rearrangements.
Tidligere har de novo oppdagelse av eccDNA var ved elektronmikroskopibilder 3, Giemsa-farging av metafase-kromosomer 4 eller to-dimensjonal gelelektroforese 5. Disse metodene gir liten eller ingen informasjon om sekvensen av det sirkulære DNA. Målrettede teknikker så som Southern blotting 6,7, invers PCR 8, eller fluorescens in situ hybridiseringn 9 dokumentere bare om bestemte eccDNA elementer. Ingen av disse metoder gir sekvensen av alle eksisterende eccDNA typer i en cellepopulasjon.
Genomisk divergens i en pool av celler kan være preget av genomsekvensering og / eller flislegging arrays 10,11. Detektere en delesjon eller forsterkning ved konvensjonelle DNA-rensemetoder krever vanligvis at en mutert allel representere minst 0,1-1% av cellepopulasjonen 12,13. Asentrisk eccDNAs er forventet å bli enda mer forbigående i en cellekultur på grunn av deres mangel på sentromerer og potensiell fravær av DNA-syntese ved replikasjon. Dermed, siden de fleste eccDNAs antagelig er i små mengder og deres sekvenser ligne genomet, er alternative DNA utvinning metoder for å påvise eccDNAs.
Flere sirkulære DNA renseteknikker utnytte de strukturelle forskjellene mellom kromosomer og sirkulært DNA. For eksempel, high-speed ultracentrifugasjon i cesium-klorid gradienter brukes til å isolere 350-3000 basepar (bp) store eccDNAs fra menneske HeLa kreftcellelinje 14. Imidlertid kan høy hastighet bryte eller kallenavn ryggrad supercoil sirkulære DNA-strukturer, endre sedimente hastighet 15 og eccDNA yield. Dutta og medarbeidere utviklet en metode for de novo, genom-skala identifisering av sirkulært DNA fra musevev så vel som fra kulturer av kylling og humane celler 16,17. Deres metode er utvinning av kjerner fra homogenisert vev av sukrose ultracentrifugation fulgt av plasmid rensing og flere runder med enzymatiske reaksjoner og DNA-ekstraksjon. Deres protokollen identifiserer primært 200-400 bp eccDNAs, kalt microDNAs. Dutta og kolleger også forsøkt rensing av microDNAs fra Saccharomyces cerevisiae, men var ikke i stand til å ta opp microDNA fra denne gjær arter 16.
Vi har utviklet en ny metode forde novo påvisning av eccDNA fra gjær kalt Circle-sekv. Denne metoden gjør det mulig genom-skala undersøkelser for sirkulære DNA-molekyler som er store nok til å bære hele gener og så store som 86 kilobase (kb) mitokondrie DNA (mtDNA). The Circle-Seq metoden ble utviklet fra en veletablert prokaryote plasmid rensing metode 18,19, optimalisert for eukaryote gjærceller og kombinert med dyp sekvensering. Bruke Circle-Seq tilnærming, 1756 forskjellige eccDNAs, alt større enn 1 kb, ble oppdaget fra ti S. cerevisiae S288C populasjoner 20. En størrelse cut-off ble valgt å fokusere på eccDNA som var store nok til å bære hele gener. Circle-Seq var svært følsom; det oppdaget et enkelt eccDNA innen tusenvis av celler 20. I denne studien ble Circle-Seq brukes til å isolere og identifisere 294 eccDNAs fra tre biologiske replikater av et annet S. cerevisiae gjærstamme, CEN.PK. Dataene viser at eccDNA er en felles genetisk element i S. cerevisiae stammer.
The Circle-Seq metoden gjør genom-skala påvisning av eccDNA fra gjærceller med sekvens-nivå oppløsning. Fremgangsmåten er en mild eccDNA rensning som ikke krever intensiv virvel eller pipettering og bruker kolonneseparering av tyngdekraften for å begrense eccDNA brudd som ville føre til eksonuklease fordøyelse i det etterfølgende trinn. Disse trekk ved fremgangsmåten kan være avgjørende for å detektere store eccDNAs som inneholder gensekvenser. Circle-Seq oppdaget mange eccDNAs inkludert fullt gener (Datasett 1). Det er også oppdaget 86-kb gjær mitokondrie-DNA. Dermed letter denne protokollen rensing av store sirkulære DNA-elementer. Slik at antallet av DNA-ekstraksjonstrinn til et minimum reduserer risikoen for tap eccDNA og maksimerer utbyttet. Basert på resultater for kontroll, piggete-in plasmider, er Circle-Seq svært følsom, oppdager en enkelt sirkulært DNA fra 2500 celler. Videre fjerner rikelig endogene plasmider som 2μ; plasmid eller mitokondrie-DNA kan betydelig forbedre følsomheten. Herding av 2μ fra gjærkulturer har blitt beskrevet 30. Alternativt 2μ og mitokondrie-DNA fjerning kan oppnås med en sjelden skjæring endonuklease, for eksempel Swai. Imidlertid kan restriksjonsenzymtrinnet målrette andre eccDNAs av interesse og begrense den totale eccDNA utbytte.
Kritiske trinn for eccDNA påvisning var fjerning av lineært DNA (trinn 3) og DNA-sekvensering (trinn 5) til en passende dybde. For å ta opp de fleste eccDNAs fra en cellepopulasjon, kanskje dypt sekvense kreves 20. Parvise end sekvensering bør gi enda større tillit eccDNA gjenkjenning, som sirkulære DNA veikryss forventes å gi parvise end leser det kartet discordantly. Disse avvik støtter oppdagelsen av sirkulære DNA-konstruksjoner, og kan potensielt brukes som en ekstra eccDNA-deteksjon filter.
The Circle-Seq Metoden ble validert ved hjelp av tre uavhengige S. cerevisiae CEN.PK populasjoner. Oppdages sekvenser inkludert tidligere rapportert eccDNAs, endogene plasmider og piggete-in plasmider og hundrevis av antatte eccDNAs (Datasett 1). Disse funnene støtter tidligere Circle-Seq datasett fra S. cerevisiae S288C 20. Oppdagelsen av flere eccDNAs felles for CEN.PK og S288C populasjoner indikerer at disse loci har en tilbøyelighet til å eksistere som sirkulære elementene (figur 4). Vi har tidligere vist at [GAP1 sirkel] er anriket under nitrogen begrensede betingelser i CEN.PK bakgrunnen 8, men bevis for [GAP1 sirkel] i andre strekk bakgrunn har ikke blitt funnet. Funn av eccDNA fra CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111, og HXT6 HXT7 loci i både S288C og CEN.PK antyder at en predisposisjon for DNA circularization er conserveres mellom gjærstammer. Det gjenstår å vise om [HXT6 / 7 sirkel], [ASP3-1 sirkel], [COS111 sirkel] og [CUP1-1 RSC30 sirkel] konferere selektive fordeler til celler eller om deres eksistens er bare en effekt av høy forekomst av DNA circularization.
Til sammen tyder resultatene på at Circle-Seq er godt egnet for å påvise kilobase store eccDNAs og har fordeler for å identifisere eccDNAs med komplett gener. Circle-Seq er en svært følsom metode som gjør det mulig for hele genom-skala skjermer av eccDNAs fra gjær. The Circle-Seq metoden kunne åpne et nytt forskningsfelt som tar sikte på å belyse hvilken rolle eccDNA i å generere genet slettinger og presiseringer. Gitt at DNA arkitektur og struktur er i stor grad bevart fra eukaryote gjær til høyere eukaryoter, Circle-Seq metoden bør i prinsippet være kan påførese til alle eukaryote celler, med små modifikasjoner. I dag gjør metoden ikke synes å ha noen begrensninger, selv om dens evne til å rense megabase størrelse eccDNAs har ennå ikke vist. I tillegg er bruken av O29 DNA-polymerase, som bruker en rullende sirkel-amplifikasjonsmetoden 31, skaper en forspenning mot mindre eccDNAs gjør eccDNA kvantifisering vanskeligere. Circle-Seq oppdager eccDNAs store nok til å bære fulle gener, noe som gjør den egnet for studier av dobbel minutter-sirkulære DNA fra humane somatiske celler. Doble minutter kan bidra til kreft når proto-onkogener blir forsterket på disse elementene 32-37. Studier av eccDNAs i germline celler kan brukes til å måle germline mutasjon priser og vurdere sædkvalitet, for eksempel i husdyr. Således har Circle-Seq potensiale til å gi innsikt i den hastighet med hvilken genetisk variasjon oppstår i form av kopitallet variasjon, og føre til en ny forståelse av sykdommer som involverer gen ko-nummer variasjon 38-40.
The authors have nothing to disclose.
Thanks to Kenn D. Møller and Claus Sternberg (DTU) for technical assistance and to Tue S. Jørgensen for quantitative PCR analysis.
Bacto peptone | BD Difco | 211677 | Alternative product can be used. |
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix | Agilent Technologies | 600882 | For qPCR analysis. Alternative product can be used. |
Dextrose (D-glucose) | Carl Roth | HN06.4 | Alternative product can be used. |
Disruptor Beads, 0.5 mm | Scientific Industries, Inc. | SI-BG05 | Glass beads to disrupt plasma cell membranes. Alternative product can be used. |
Ethidium bromide | Carl Roth | 2218.2 | Agarose gel stain for detecting DNA/RNA. |
GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo Fisher | K0502 | Plasmid purifcation from bacteria. Alternative product can be used |
NotI, FastDigest | Life Technologies - Thermo Fisher Scientific, USA | FD0594 | Endonuclease. Alternative product can be used. |
Plasmid Mini AX kit | A&A Biotechnology, Poland | 010-50 | Plasmid purifcation kit used to purify eccDNA. |
Plasmid-Safe ATP-dependent DNase kit | Epicentre, USA | E3105K | ATP-dependent exonuclease kit. Alternative product can be used. |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich, USA | 81845 | Alternative product can be used. |
pUG6 plasmid | EUROSCARF, Germany | P30114 | Marker gene: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP. Plasmid requests: Please contact Dr. Peter Philippsen@unibas.ch |
QIAGEN genomic-tip 100/G | Qiagen, USA | 13343 | Genomic DNA purifcation from yeast. Alternative product can be used. |
REPLI-g Mini Kit protocol | Qiagen, USA | 150023 | Amplification of eccDNA by the phi29 polymerase |
Yeast extract | BD Difco | 210929 | Alternative product can be used. |
Zymolyase 100T (Lyticase, Yeast Lytic Enzyme) | Nordic BioSite, Sweden | Z1004-3 | Alternative product can be used. |
Data access to sequence files | European Nucleotide Archive | EccDNA dataset from Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D. Study accession number PRJEB9684. 2nd accession number is ERP010820. Locus tag prefix is BN2032. | |
Strains | |||
Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D | Genotype MATa MAL2-8c SUC2 | ||
Saccharomyces cerevisiae yeast deletion library pool | EUROSCARF, Germany | S288c BY4741 pool of 4400 viable single-gene deletion mutants disrubted by KanMX module. Genotypes MATa his3∆1 leu2∆0 met15∆0 ura3∆0 genexxx::KanMX. | |
Equipments | |||
DNA Spectrophotometer | NanoDrop 1000 Spectrophotometer, Thermo Fisher | Measuring DNA concentration. Alternative product can be used. | |
Fluorescence microscopy | Nikon Optronics Magnafire. Red excitation fluorescence filter, 663-738 nm. | Alternative product can be used. | |
Robotic library-build system | Apollo 324, IntegenX Inc. | DNA library preparation. Alternative product can be used. | |
Sequencing platform | Illumina HiSeq 2000 platform, Illumina Inc. | DNA sequencing. Alternative product can be used. | |
Ultrasonicator | Covaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubes | Alternative product can be used. | |
Methods | |||
2% YPD media | Mix 10 g Dextrose, 10 g Yeast extract, 20 g Bacto peptone and add H2O to a total volume of 1000 ml and autoclave. | ||
Circle-Seq test on genomic DNA | Genomic DNA was purified (Qiagen) from a pool of the yeast deletion library (Euroscarf). The DNA concentration was measured by nanodrop and 30 µg genomic DNA was pipetted into two micro centrifuge tubes. One micro centrifuge tube was supplemented with 100 nanogram plasmid (pUG6). The DNA samples were purified by Circle-Seq, omitting the protocol steps 1.1-1.3 and 1.5-1.7. The eluted DNA concentrations were measured by nanodrop and the entire DNA yield from sample GD and GD+P was treated with exonuclease for a period of 29 hours. A 10% fraction was collected for phi29-amplification and PCR analysis, while the remaining DNA was subjected to 72 hour exonuclease treatment. The samples were analyzed for linear DNA content by PCR, using the ACT1 gene as chromosomal marker. A 5% fraction of each of the exonuclease treated samples was amplified by the phi29 DNA polymerase for 16 hours (Qiagen). The presence of DNA in each sample was examined by loading an equal amount (7 µl) in wells on an 0.5 µg/ml ethidium-bromide 0.9% agarose gel after running gel-electrophoresis. | ||
Mapping software | Bowtie2 aligner, John Hopkins University | Ultrafast short read alignment. Reference: Langmead B, Salzberg S. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 2012, 9:357-359. | |
Propidium iodide stain | Images of propidium iodine stained DNA were captured by fluorescence microscopy at 100x magnification (100x/1.30 oil, Nikon) in the RFP channel (red excitation fluorescence filter, 663-738 nm) using identical exposition time (5 seconds). | ||
Workflow bioinformatic system | Galaxy, Open source. | A free web-based platform for data intensive biomedical research. References: Goecks, J, Nekrutenko, A, Taylor, J and The Galaxy Team. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 2010 Aug 25;11(8):R86. Blankenberg D, Von Kuster G, Coraor N, Ananda G, Lazarus R, Mangan M, Nekrutenko A, Taylor J. "Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists". Current Protocols in Molecular Biology. 2010 Jan; Chapter 19:Unit 19.10.1-21. Giardine B, Riemer C, Hardison RC, Burhans R, Elnitski L, Shah P, Zhang Y, Blankenberg D, Albert I, Taylor J, Miller W, Kent WJ, Nekrutenko A. "Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis." Genome Research. 2005 Oct; 15(10):1451-5. |