Functionele karakterisering van regulerende macrofagen die de transplantaatreactieve immuniteit verhinderen
Summary
Macrofagen zijn plastic cellen van het hematopoietische systeem die een cruciale rol spelen in beschermende immuniteit en homeostase. In dit rapport beschrijven we geoptimaliseerde in vitro technieken voor het fenotypisch en functioneel karakteriseren van transplantatie-infiltrerende regulerende macrofagen die zich in het getransplanteerde orgaan verzamelen onder tolerogene omstandigheden.
Abstract
Macrofage accumulatie in getransplanteerde organen is al lang herkend als een kenmerk van allograft afwijzing 1 . Immunogene monocyten infiltreren de allotransplantatie vroeg na transplantatie, bevestig een transplantaatreactieve reactie tegen het getransplanteerde orgaan en start orgaanafstoting 2 . Recente gegevens suggereren dat onderdrukkende macrofagen succesvolle langetermijntransplantatie 3 vergemakkelijken en nodig zijn voor de inductie van transplantatietolerantie 4 . Dit suggereert een multidimensionaal concept van macrofage ontogenie, activatie en functie, die een nieuwe routekaart vereist voor de isolatie en analyse van macrofage functie 5 . Vanwege de plasticiteit van macrofagen is het nodig een methode te geven om macrofagen te isoleren en te karakteriseren, afhankelijk van de weefselomgeving, en om hun functies te definiëren volgens verschillende scenario's. Hier worden we beschrevenEen protocol voor immuun karakterisering van transfusie-infiltrerende macrofagen en de methoden die we functioneerden om hun capaciteit te evalueren om CD8 + T proliferatie te remmen en om de groei van CD4 + Foxp3 + Treg in vitro te bevorderen.
Introduction
Dit protocol beschrijft in vitro technieken om de functie van weefsel-infiltrerende macrofagen die geïsoleerd zijn van cardiale allografen te bestuderen, volgens hun vermogen om T-cel responsen te moduleren. In de literatuur worden fluorescerende celopsporingskleurstoffen in combinatie met flowcytometrie beschreven, krachtige hulpmiddelen om de onderdrukkende functie van specifieke celsoorten in vitro en in vivo te bestuderen . Ons protocol volgt de carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) methode voor het monitoren van lymfocyt proliferatie in vitro .
Wanneer een CFSE-gemarkeerde cel verdeelt, verwerft zijn nageslacht het halve aantal carboxyfluoresceïne-gelabelde moleculen 6 . De bijbehorende afname in celfluorescentie door flowcytometrie kan worden gebruikt om celverdeling te beoordelen, de capaciteit van onderdrukkende macrofagen te monitoren om T-cel immuunresponsen te moduleren. Aangezien CFSE een fluoresceïne-gebaseerde kleurstof is, is het compatibel met een brOad reeks van andere fluorochromen, waardoor het van toepassing is op multi-color flow cytometry. De juiste keuze van fluorochromen voor fenotyping is ook belangrijk om overmatige spectrale overlap te vermijden en het onvermogen om antilichaam-positieve cellen te herkennen, met name met zichtbare proteïne kleurstoffen zoals CFSE 7 .
Er zijn vele voordelen van het gebruik van fluorescerende kleurstoffen over alternatieve technieken die cel proliferatie meten, zoals de thymidine incorporation assay, die radioactief gelabelde thymidine (TdR) 8 gebruikt . Deze bepaling maakt gebruik van tritiated thymidine ( 3 H-TdR) die in de nieuwe strengen van chromosomaal DNA is opgenomen tijdens de mitotische celdeling. Een veiligheidsprobleem in verband met deze analyse is het gebruik van radio-isotopen, aangezien een scintillatie-beta-teller gebruikt wordt om de radioactiviteit te meten in DNA die uit de cellen is hersteld om de mate van celverdeling te bepalen. Methodologisch, de tritiated thymidine assAy is niet flexibel genoeg om belangrijke klinische laboratorium beperkingen aan te passen, zoals een laag aantal cellen en vertraagde analyse na kleuring. Integendeel, CFSE-kleuring is aangetoond dat cel proliferatie voorkomt en interfereren met kritische activatie markers, zoals CD69, HLA-DR en CD25 9 . Daarom begrijpen de voordelen en beperkingen van elke methodologie, met name in multicolor studies waarbij meerdere kleurstoffen worden gebruikt om verschillende celtypes te volgen, om kritische en reproduceerbare resultaten te verkrijgen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de methoden die we gebruikt om immuun-infiltrerende myeloïde cel subsets te immunocharacteriseren in een experimenteel murine model van harttransplantatie, die ook van toepassing is op andere weefsels in verschillende muizen experimentele modellen. Lage drukcellen sorteren bij 20 psi was de voorkeursmethode om een goede opbrengst van subgroepen met zuivere cellen te isoleren. Het behouden van de zuiverheid van elke myeloïde subset is essentieel om afdoende resultaten van de onderdrukkende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij erkennen de technische bijdragen van de Flow Cytometry, Microchirurgie, en Bio-repository / Patologie Centra of Excellence in onderzoek in Mount Sinai. Dit werk werd ondersteund door de COST Action BM1305: Actie om de Tolerogene Therapieën van de Cel te concentreren en te versnellen (FACTT), de ontwikkelingsfondsen van het Sinai Recanati / Miller Transplantatie Instituut, Ministerio de Ciencia en Innovacion SAF2013-48834-R en SAF2016-80031-R JO
Materials
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 100X Non Esential amino acids | Corning | 25025039 | |
| 1M HEPES buffer | Corning | 25060CL | |
| 100mM Sodium Pyruvate | ThermoScientific | SH30239.01 | |
| Penicilin/Streptavidyn | ThermoScientific | 15140122 | |
| Collagenese A | Roche | 70381322 | |
| DPBS (w/o calcium&magnesium) | Corning | 21031CV | |
| 70 micron Cell strainer | Fisher | 22363548 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5mg-F | |
| CFSE-FITC | Invitrogen | C34554 | |
| Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11452D | |
| 96 well U-bottom plate | Corning | 353077 | |
| Antibodies: | |||
| anti-Ly6C-APC | eBioscience | 175932-80 | |
| anti-Ly6G-Pe/Cy7 | Biolegend | 127617 | |
| anti-CD11b-Percp/Cy5.5 | eBioscience | 45011282 | |
| anti-CD45-APC/Cy7 | eBioscience | 47045182 | |
| anti-CD4-APC | eBioscience | 17004181 | |
| anti-CD8-P/ Cy7 | eBioscience | 25008181 | |
| LSRII Flow Cytometer | BD Bioscience | ||
| FACSDiva Software | BD Bioscience | ||
| C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J | The Jackson Laboratory | 008374 | |
| C57BL/6 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Balb/c | The Jackson Laboratory | 000651 |
References
- Jose, M. D., Ikezumi, Y., van Rooijen, N., Atkins, R. C., Chadban, S. J. Macrophages act as effectors of tissue damage in acute renal allograft rejection. Transplantation. 76 (7), 1015-1022 (2003).
- Oberbarnscheidt, M. H., et al. Non-self recognition by monocytes initiates allograft rejection. J Clin Invest. 124 (8), 3579-3589 (2014).
- Garcia, M. R., et al. Monocytic suppressive cells mediate cardiovascular transplantation tolerance in mice. J Clin Invest. 120 (7), 2486-2496 (2010).
- Conde, P., et al. DC-SIGN(+) Macrophages Control the Induction of Transplantation Tolerance. Immunity. 42 (6), 1143-1158 (2015).
- Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function. Nat Immunol. 17 (1), 34-40 (2016).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. J Vis Exp. (88), e51627 (2014).
- Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J Vis Exp. (70), e4287 (2012).
- Poujol, F., et al. Flow cytometric evaluation of lymphocyte transformation test based on 5-ethynyl-2’deoxyuridine incorporation as a clinical alternative to tritiated thymidine uptake measurement. J Immunol Methods. 415, 71-79 (2014).
- Last’ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers. Cell Immunol. 256 (1-2), 79-85 (2009).
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp. (6), e238 (2007).
- Ochando, J., Conde, P., Bronte, V. Monocyte-Derived Suppressor Cells in Transplantation. Curr Transplant Rep. 2 (2), 176-183 (2015).
- Gallina, G., et al. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J Clin Invest. 116 (10), 2777-2790 (2006).
- Huang, B., et al. Gr-1+CD115+ immature myeloid suppressor cells mediate the development of tumor-induced T regulatory cells and T-cell anergy in tumor-bearing host. Cancer Res. 66 (2), 1123-1131 (2006).
- Luan, Y., et al. Monocytic myeloid-derived suppressor cells accumulate in renal transplant patients and mediate CD4(+) Foxp3(+) Treg expansion. Am J Transplant. 13 (12), 3123-3131 (2013).
- Tario, J. D., Muirhead, K. A., Pan, D., Munson, M. E., Wallace, P. K. Tracking immune cell proliferation and cytotoxic potential using flow cytometry. Methods Mol Biol. 699, 119-164 (2011).
