Une cytométrie en flux simple méthode pour mesurer l'absorption du glucose et de glucose Expression Transporter pour monocytes dans les sous-populations de sang total
Summary
Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.
Abstract
Les monocytes sont des cellules immunitaires innées qui peuvent être activées par des agents pathogènes et l'inflammation associées à certaines maladies inflammatoires chroniques. L'activation des monocytes induit des fonctions effectrices et un déplacement concomitant de l'oxydation du métabolisme glycolytique qui est accompagnée par une expression accrue de glucose dans le transporteur. Ce métabolisme glycolytique augmentation est également observée pour l'immunité formé des monocytes, une forme de mémoire immunologique innée. Bien que les protocoles in vitro examinant l' expression du transporteur du glucose et de l' absorption du glucose par les monocytes ont été décrits, aucun n'a été examiné par un flux multi-paramétrique cytométrie sur sang total. Nous décrivons un protocole de cytométrie de flux multi-paramétrique pour la mesure de la fluorescence du glucose analogique à 2 NBDG l' absorption dans le sang total par les monocytes total et le classique (CD14 ++ CD16 -), intermédiaire (CD14 ++ CD16 +) et non classique ( cellules CD14 + CD16 ++) monocytesous-populations. Cette méthode peut être utilisée pour examiner l'expression du transporteur de glucose et l'absorption du glucose pour les monocytes totaux et les sous-populations de monocytes pendant homéostase et de la maladie inflammatoire, et peut être facilement modifié pour examiner l'absorption du glucose pour d'autres leucocytes et des sous- populations de leucocytes au sein du sang.
Introduction
Les monocytes sont un composant majeur du système immunitaire inné humain qui sont rapidement mobilisée vers les sites d'infection et d' inflammation 1. L' activation des monocytes est essentielle pour limiter les dommages aigus par des agents pathogènes et est également au centre de la pathogenèse de plusieurs maladies chroniques, y compris l' athérosclérose 2, le cancer 3, et le VIH 4,5.
Le métabolisme de repos et des monocytes activés diffère de façon spectaculaire, avec des monocytes au repos en utilisant le métabolisme oxydatif et les monocytes activés en utilisant le métabolisme glycolytique (ie, la fermentation du glucose en lactate) 6. L' activation des monocytes induit l' expression des transporteurs de glucose qui permet d'accroître l' absorption de glucose pour le métabolisme glycolytique 7. Monocyte transporteur de glucose 1 (Glut1) est un tel transporteur upregulated lors de l'activation et son expression a été démontré que conduire à la production de cytokines pro-inflammatoires dans vitro et dans le tissu adipeux des souris obèses 8. L' infection d'une lignée cellulaire monocytaire par Kaposi associé herpèsvirus conduit à une régulation positive cellulaire Glut1 9, et nous avons récemment montré qu'au cours de l' infection chronique par le VIH d' une augmentation du pourcentage de monocytes de Glut1 exprimant sont présents au cours de l' infection par le traitement traité par antirétroviraux non traitée et la combinaison 10. Pris ensemble, ces études montrent que l'absorption du glucose et du métabolisme glycolytique par les monocytes sont des aspects importants de nombreuses maladies inflammatoires. Ainsi, une méthode simple pour mesurer l'expression des monocytes Glut1 et l'absorption du glucose au cours de l'homéostasie et la maladie inflammatoire est susceptible d'être utile à un large éventail de chercheurs.
Les monocytes humains sont hétérogènes, étant constitué de trois sous – ensembles distincts qui peuvent être examinés par l' expression différentielle des marqueurs de la surface cellulaire CD14 et CD16 11,12. monocytes classiques expriment un niveau élevé de CD14, mais n'expriment CD16 (CD14 ++ CD16 -), monocytes intermédiaires expriment un niveau élevé de CD14 et un niveau intermédiaire de CD16 (CD14 ++ CD16 +) et non-classique monocytes expriment un faible niveau de CD14 et un niveau élevé de CD16 (CD14 + CD16 ++). Monocytes exprimant CD16 sont appelées CD16 +, des monocytes qui ont comparé au CD16 – les monocytes ont une forte expression de cytokines inflammatoires et de la capacité de manière plus efficace des antigènes présents 13,14. Environ 10% des monocytes expriment CD16 au cours de l' homéostasie avec des pourcentages plus élevés observés au cours de l' inflammation 15. Sous – populations de monocytes sont associés à certains états pathologiques et pourraient être des marqueurs biologiques utiles de la maladie et progression de la maladie 16.
Notre objectif était d'identifier une méthode qui permet de mesurer l'expression du transporteur de glucose et de l'absorption du glucose par les monocytes humains et des sous-populations de monocytes dans des conditions aussi proches phyconditions siologique que possible. Des études antérieures mesurées monocytes glucose expression du transporteur et de l' absorption du glucose 17,18, bien que ces méthodes examinées monocytes isolés qui peuvent avoir modifié l' expression des protéines par rapport à des conditions physiologiques 19, et aucune étude précédente a examiné les sous – populations de monocytes humains. En utilisant un écoulement multi-paramétrique cytométrie, nous décrivons une méthode pour étudier l'expression du transporteur de glucose et de l'absorption du glucose analogue fluorescent 2-NBDG par les monocytes totaux et les sous-populations de monocytes (basé sur l'expression de CD14 et CD16) dans le sang entier non manipulée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici en détail une méthode simple pour étudier l'expression du transporteur de glucose et fluorescent absorption d'analogue du glucose par les monocytes et les sous-populations de monocytes dans le sang entier. En évaluant 2 NBDG l' absorption dans le sang entier, cette technique permet des conditions similaires à celles in vivo. Une précédente étude a examiné 6-NBDG absorption dans les monocytes séparés du sang total par la densité centrifugation 17. Cepen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Centre australien pour le VIH et l' hépatite Virology Research (ACH 2) et une subvention de développement 2010 (CNIHR) de l'Université de Washington Center for AIDS Research (CFAR), un programme financé par le NIH sous le numéro attribution AI027757 qui est soutenu par le NIH Instituts suivants et les centres (NIAID, NCI, NIMH, NIDA, NICHD, NHLBI, NIA). CSP est un bénéficiaire de la CNIHR et ACH 2 subvention. SMC est récipiendaire d'un Conseil de recherche en santé et médicale nationale d'Australie (NHMRC) Principal Research Fellowship. Les auteurs remercient la contribution à ce travail du Programme opérationnel d'appui aux infrastructures victorienne reçue par l'Institut Burnet. Nous reconnaissons l'aide de Geza Paukovic et Eva Orlowski-Oliver de la Facilité AMREP cytométrie de flux de base pour cytométrie en flux de formation et des conseils techniques. Nous remercions Angus Morgan pour le coaching et l'organisation du tournage du clip média. Notre gratitudeJesse Masson et Jehad Abdulaziz K. Alzahrani d'assistance laboratoire pendant le tournage vidéo. Nous remercions les efforts du Dr David Simar à l'École des sciences médicales, UNSW, Australie qui ont offert des conseils méthodologiques critique. CSP tient à remercier www.nice-consultants.com des consultations graphiques.
CONTRIBUTION AUTEURS:
CSP a conçu le projet, conçu et mené des expériences, analysé et interprété les données, et a écrit le manuscrit. JJA interprété les données et a écrit le manuscrit. TRB a écrit le manuscrit. JMM interprété les données, a fait des suggestions intellectuelles critiques, et a examiné le manuscrit. SMC a interprété les données, a fait des suggestions intellectuelles critiques et a examiné le manuscrit.
Materials
| VACUETT Tube 9 ml ACD-B anticoagulant tubes | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml sterile polypropylene tubes | BD Biosciences | 352063 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% formaldehyde solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS lysing solution (10X) | BD Biosciences | 349202 | Dilute BD FACS lysing solution 1/10 with deionized water for working concentration (store for up to 1 week at 4°C) |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | Suspend 5 mg of 2-NBDG into 1 ml of deionized water to make a 14.60 mM stock solution (keep for up to 6 months at 4°C). To make the working 2-NBDG concentration, dilute stock 1/100 with 1X DPBS. Cover with foil. (store for up to 1 week at 4°C) |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (1X) | Life technologies | 14190-144 | To make wash solution, add 0.5 g BSA per 100 ml DPBS (store for up to 2 weeks at 4°C) |
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