体外转录测定及其在药物研究中的应用
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
体外转录测定法已被开发并广泛使用了许多年，以研究参与转录的分子机制。这个过程需要多亚基DNA依赖性RNA聚合酶（RNAP）等一系列的，其作用的基因表达过程中调节RNA聚合酶的活性转录因子。放射性成绩单的测序凝胶电泳用于提供关于如何转录所得，哪些参数可以影响它的详细机理信息。在本文中，我们描述了协议来研究必不可少延伸因子的NusA如何调控转录暂停，以及一个以确定抗菌剂通过抑制RNA聚合酶全酶形成指定转录起始方法。这些方法可用于一个作为平台的额外方法的发展探索转录因子的作用机制仍然不清楚，以及新的抗菌阿根TS靶向转录这是在抗生素研发的未充分利用的药物靶标。
Introduction
转录是在其中RNA是从一个特定的DNA模板合成的过程。在真核细胞中有三个不同的RNAPs：RNA聚合酶我转录rRNA的前体，RNA聚合酶II负责mRNA和某些小核RNA的合成，和5S rRNA基因和tRNA的合成是通过RNA聚合酶III进行的。在细菌中，有负责RNA的所有类的转录只有一个RNAP。有转录三个阶段：起始，延伸和终止。转录是在细胞中最高度调节过程中的一个。 在转录周期各阶段表示基因表达1的调节一个检查点。为起始，RNA聚合酶具有与σ因子相关联，以形成全酶，这是需要以引导酶特定网站的所谓启动子2以形成一个开放的启动子复合物。随后，大套房的转录因子负责监管Ô在延伸和终止阶段˚FRNA聚合酶活性。这里研究的转录因子是高度保守的和必需的蛋白质，的NusA。它参与rRNA的合成3-5中调节转录暂停和终止，以及抗终止。
体外转录测定法已被开发作为有力工具转录6中学习复杂的调节步骤。在一般情况下，DNA的包括一个启动子区的线性片段是必需的作为模板进行转录。 DNA模板通常是通过PCR或通过线性化的质粒产生的。纯化的蛋白质和的NTPs（包括一个放射性标记的NTP为检测的目的），然后加入和产品分析培养所需要的时间以下。使用相应的模板和反应条件，一直在使用这种方法，它使得transcr详细的分子特征研究转录的各个阶段iption在过去的半个世纪7。在与RNA聚合酶的三维结构信息的组合，它也是可能探测由抗生素和抗生素引线转录抑制的分子机制，以及在新的，改进的药物8-10开发使用此信息。
在这项工作中，我们提供的转录分析如何可以被用来确定由转录延伸/终止因子的NusA，以及如何能够确定的一个新的转录起始抑制剂引线的作用机制的调节机制的例子。
Protocol
注意：实验涉及使用放射性同位素32 p和没有工作应该进行，直到所有适当的安全条件已经具备。一般人员都必须参加安全课程，并接受之前，使用放射性试剂的实验监督的做法。请佩戴个人防护装备进行反应时（热释光剂量计，防护眼镜，手套，放射室实验室外套，全长裤，封闭趾鞋）。 1.试验材料的制备获取所需的蛋白质转录分析。 对于这里所描述的实验中，过量?…
Representative Results
转录效率可以通过测量在不同时间点的频段辐射水平来确定。的暂停检测来测试启用暂停，终止的可视化的NusA因子的功能，和径流制品（ 图1A）。在的NusA的N-末端结构域的存在（的NusA NTD;氨基酸残基1-137）时，RNA产物的外观相比缺乏的NusA对照实验显著延迟。的的NusA片段，或改变的一系列氨基酸的丙氨酸的氨基酸残基104-137（螺旋3）缺失（残基K36，K37，R104，Q10…
Discussion
在所有生物中，转录是一严格调节的过程。 在体外已经开发转录测定，以用于测试的转录因子，小分子和转录抑制剂的影响提供了平台。在该方法中纸张，被描述为一般细菌转录的测定法。因为它们允许沿时间线中的所有转录产物可视化转录实验与成绩单的测序凝胶电泳结合是机理研究非常重要。其结果是，这种方法是能够识别的在反应条件下小的变化的影响，并露出动作的一个可行的机…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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Cite This Article
Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).