In vitro-transskription Analyser og deres anvendelse i Drug Discovery
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
In vitro er blevet udviklet transskription assays og bredt anvendt i mange år til at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i transskription. Denne proces kræver multi-subunit DNA-afhængig RNA-polymerase (RNAP) og en række transkriptionsfaktorer, som virker til at modulere aktiviteten af RNAP under genekspression. Sekventering gelelektroforese af radioaktivt mærkede udskrifter bruges til at give detaljerede mekanistisk information om, hvordan transskription provenu og hvilke parametre kan påvirke den. I denne artikel beskriver vi protokollen at undersøge, hvordan det væsentlige elongeringsfaktor NusA regulerer transkriptionel pause, såvel som en fremgangsmåde til at identificere et antibakterielt middel målretning transkriptionsinitiering gennem hæmning af RNAP holoenzym formation. Disse metoder kan anvendes en som platform for udvikling af yderligere fremgangsmåder til at udforske virkningsmekanismen for de transkriptionsfaktorer, som stadig uklart, såvel som nye antibakterielle agents målretning transkription, som er en underudnyttet lægemiddelmål i antibiotisk forskning og udvikling.
Introduction
Transkription er den proces, hvor RNA syntetiseres ud fra en specifik DNA-skabelon. I eukaryote celler der er tre forskellige RNAPs: RNAP I transskriberer rRNA forstadier, RNAP II er ansvarlig for syntesen af mRNA og visse små nukleare RNA'er, og syntesen af 5S rRNA og tRNA udføres ved RNAP III. I bakterier, er der kun én RNAP ansvarlig for transkriptionen af alle klasser af RNA. Der er tre stadier af transskription: initiering, forlængelse og ophør. Transskription er en af de mest stærkt regulerede processer i cellen. Hver fase i transskription cyklus repræsenterer en kontrolpost for regulering af genekspression 1. For initiering, RNAP har at associere med en sigma faktor til dannelse holoenzym, som er nødvendige for at dirigere enzymet til specifikke steder kaldes promotorer 2 til dannelse af et åbent promotorkompleks. Efterfølgende en stor suite af transkriptionsfaktorer er ansvarlige for regulering of RNAP aktiviteter i løbet af forlængelse og opsigelse faser. Transkriptionsfaktoren undersøgt her er den stærkt konserveret og essentielt protein, NusA. Det er involveret i reguleringen af transskription pause og opsigelse, samt anti-afslutning i løbet af rRNA syntese 3-5.
In vitro er blevet udviklet transskription analyser som effektive værktøjer til at studere de komplekse regulerende trin under transskription 6. Generelt er et lineært fragment af DNA, herunder en promotorregion kræves som template for transkription. DNA-templaten er normalt dannet ved PCR eller ved linearisering af et plasmid. Oprensede proteiner og NTP'er (herunder en radioaktivt mærket NTP til afsløring formål) tilsættes derefter og produkt analyseret efter den krævede inkubationstid. Brug passende skabeloner og reaktionsbetingelser, har alle faser af transskription blevet undersøgt ved hjælp af denne metode, som har gjort det muligt detaljeret molekylær karakterisering af transcription løbet af det sidste halve århundrede 7. I kombination med oplysninger om den 3-dimensionelle struktur RNAP har det også været muligt at undersøge den molekylære mekanisme af transskription hæmning af antibiotika og antibiotiske kundeemner, og bruge denne information til udvikling af nye og forbedrede lægemidler 8-10.
I dette arbejde er der mange eksempler på, hvordan transskription assays kan anvendes til at bestemme mekanismen for regulering af transkription forlængelse / termineringsfaktor NusA, og hvordan kan bestemmes virkningsmekanismen af et hidtil ukendt transkriptionsinitiering inhibitor bly.
Protocol
Representative Results
Discussion
I alle organismer, transkription er et tæt reguleret proces. In vitro transcription assays er blevet udviklet for at tilvejebringe en platform for afprøvning af effekten af transkriptionsfaktorer, små molekyler og transskription inhibitorer. I denne fremgangsmåde papir, blev et assay til generel bakteriel transkription beskrevet. Transskription assays kombineret med sekventering gelelektroforese af transkripter er meget vigtige for mekanistiske undersøgelser, da de tillader visualisering af alle transkript…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
