In vitro transcriptie Testen en hun toepassing in Drug Discovery
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
In vitro transcriptie assays ontwikkeld en op grote schaal gebruikt voor vele jaren de moleculaire mechanismen van transcriptie bestuderen. Dit proces vereist meerdere subeenheden DNA-afhankelijke RNA polymerase (RNAP) en een aantal transcriptiefactoren die fungeren om de activiteit van RNAP moduleren tijdens genexpressie. Sequencing gelelektroforese radiogelabeld transcripten op gedetailleerde mechanistische informatie over transcriptie verloopt en welke parameters kan beïnvloeden verschaffen. In dit artikel beschrijven we het protocol te onderzoeken hoe de essentiële verlengingsfactor Nuša reguleert transcriptie onderbreken, evenals een methode om een antibacterieel middel gericht transcriptie-initiatie door remming van RNAP holo vorming identificeren. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt als een platform voor de ontwikkeling van additionele benaderingen voor het werkingsmechanisme van de transcriptiefactoren die nog onduidelijk, evenals nieuwe antibacteriële agen staandts richt transcriptie dat is een weinig gebruikte drug target in antibiotische onderzoek en ontwikkeling.
Introduction
Transcriptie is het proces waarbij RNA wordt gesynthetiseerd uit een specifieke DNA-matrijs. In eukaryote cellen zijn er drie verschillende RNAPs: RNAP I transcribeert rRNA precursors, RNAP II verantwoordelijk is voor de synthese van mRNA en bepaalde kleine nucleaire RNA's worden gesynthetiseerd 5S rRNA en tRNA wordt uitgevoerd door RNAP III. In bacteriën, is er slechts één RNAP verantwoordelijk voor de transcriptie van alle klassen van RNA. Er zijn drie fasen van de transcriptie: initiatie, verlenging en beëindiging. Transcriptie is een van de meest gereguleerde processen in de cel. Elke fase in de transcriptie cyclus vertegenwoordigt een controlepost voor de regulering van genexpressie 1. Bij het opstarten, RNAP te associëren met een sigma factor holo vormen, die nodig is om het enzym aan specifieke plaatsen tussen genoemd promoters 2 een open promoter complex. Vervolgens werd een grote suite van transcriptiefactoren verantwoordelijk zijn voor de regulering oactiviteiten f RNAP tijdens de verlenging en beëindiging fasen. De transcriptiefactor hier onderzocht is de sterk geconserveerd en essentiële eiwitten, Nusa. Het is betrokken bij het reguleren van transcriptie pauzeren en terminatie, evenals anti-beëindiging tijdens rRNA synthese 3-5.
In vitro transcriptie assays zijn ontwikkeld als krachtige hulpmiddelen om de complexe regulerende stappen bestuderen bij transcriptie 6. In het algemeen wordt een lineair fragment van DNA omvattende een promotergebied vereist als de matrijs voor transcriptie. De DNA-matrijs wordt doorgaans gegenereerd door PCR of door het lineariseren van een plasmide. Gezuiverde eiwitten en NTP's (waaronder een radioactief gemerkte NTP voor detectie doeleinden) worden dan toegevoegd en product geanalyseerd volgens de vereiste incubatietijd. Met behulp van geschikte templates en reactie-omstandigheden, hebben alle stadia van transcriptie onderzocht met behulp van deze aanpak, die gedetailleerde moleculaire karakterisering van transcr heeft ingeschakeldiption in de afgelopen halve eeuw 7. In combinatie met informatie over de 3-dimensionale structuur van RNAP is het ook mogelijk zijn om het moleculaire mechanisme van transcriptie remming door antibiotica en antibiotica leads sonde, en deze informatie in de ontwikkeling van nieuwe, verbeterde geneesmiddelen 8-10.
In dit werk geven we voorbeelden van hoe transcriptie assays kunnen worden gebruikt voor het regulatiemechanisme van transcriptie elongatie / beëindiging factor Nuša en hoe het werkingsmechanisme van een nieuwe transcriptie-initiatie remmer lood kan worden bepaald.
Protocol
Representative Results
Discussion
In alle organismen, transcriptie strak gereguleerd proces. In vitro transcriptie assays zijn ontwikkeld om een platform voor het testen van de effecten van transcriptiefactoren, kleine moleculen en transcriptie remmers. Bij deze werkwijze document, een bepaling voor algemene bacteriële transcriptie beschreven. Transcriptie assays gecombineerd met sequentie gelelektroforese transcripten zijn zeer belangrijk voor mechanistische studies mocht visualisatie van de transcriptie producten langs een tijdlijn toestaan….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
