במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
במבחנת מבחני שעתוק פותחו בשימוש נרחב במשך שנים רבות כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המעורבים שעתוק. תהליך זה דורש RNA פולימראז רב למקטע תלוי DNA (RNAP) וסדרה של גורמי שעתוק שפועלים כדי להשפיע על פעילותם של RNAP במהלך ביטוי גנים. רצף ג'ל אלקטרופורזה של תמלילי רדיואקטיבי משמשת כדי לספק מידע מכניסטית מפורט על איך תמורת שעתוק ומה פרמטרים יכול להשפיע על זה. במאמר זה נתאר את הפרוטוקול ללמוד כיצד גורם התארכות החיונית נוסה מסדיר ששהייה תעתיק, כמו גם שיטה לזיהוי סוכן אנטיבקטריאלי מיקוד ייזום שעתוק באמצעות עיכוב של היווצרות holoenzyme RNAP. שיטות אלה יכולים לשמש כפלטפורמה לפיתוח גישות נוספות כדי לחקור את מנגנון הפעולה של גורמי התעתוק אשר עדיין אינו ברור, כמו גם Agen אנטיבקטריאלי חדשts מיקוד שעתוק אשר מהווה יעד תרופה מנוצלים במחקר ופיתוח אנטיביוטי.
Introduction
תמלול הוא התהליך שבו RNA מסונתז מתבנית DNA ספציפית. בתאים איקריוטיים ישנם שלושה RNAPs ברורים: RNAP שאני מעתיק מבשרי rRNA, RNAP השנייה אחראי לסינתזה של mRNA ו RNAs הגרעיני הקטן מסוים, ואת הסינתזה של 5S rRNA ו tRNA מבוצעת על ידי RNAP III. אצל חיידקים, יש רק אחד RNAP אחראי שעתוק של כל סוגי RNA. ישנם שלושה שלבים של שעתוק: ייזום, התארכות והפסקה. תמלול הוא אחד התהליכים המוסדרים הגבוה ביותר בתא. כל שלב במחזור שעתוק מייצג מחסום להסדרת ביטוי גנים 1. לקבלת החניכה, RNAP יש לשייך גורם סיגמא לגבש holoenzyme, אשר נדרש לכוון את האנזים לאתרים ספציפיים בשם היזמים 2 כדי ליצור תסביך האמרגן פתוח. בהמשך לכך, חבילה גדולה של גורמי שעתוק האחראים o תקנהf RNAP פעילויות במהלך שלבי התארכות והפסקה. גורם השכפול נבחן כאן הוא החלבון השמור ביותר וחיוני, נוסה. הוא מעורב בויסות שהשהית שעתוק והפסקה, כמו גם סיום אנטי במהלך סינתזת rRNA 3-5.
במבחנה מבחני שעתוק פותחו כלים רבי עוצמה כדי ללמוד את הצעדים הרגולטוריים מורכבים במהלך שעתוק 6. באופן כללי, שבר ליניארי של DNA כולל אזור האמרגן נדרש כתבנית עבור שעתוק. תבנית ה- DNA בדרך כלל מופק על ידי PCR או על ידי ליניאריזציה פלסמיד. חלבונים NTPs מטוהרים (כולל רדיואקטיבי אחד NTP למטרות זיהוי) מתווספים אז המוצר ניתח בעקבות התקופה הנדרשת של דגירה. שימוש בתבניות מתאימות ותנאי תגובה, בכל שלבי שעתוק נבחנו באמצעות גישה זו אשר אפשרה אפיון מולקולרי מפורט של transcription לעומת מחצית המאה הקודמת 7. בשילוב עם מידע על המבנה 3-הממדי של RNAP זה גם יכל לחקור את המנגנון המולקולרי של עיכוב שעתוק על ידי אנטיביוטיקה מובילה אנטיביוטי, ולהשתמש במידע זה בפיתוח תרופות חדשות, שיפור 8-10.
בעבודה זו אנו מספקים דוגמאות לאופן מבחני שעתוק יכולים לשמש כדי לקבוע את מנגנון הוויסות ידי התארכות שעתוק / גרם סיום נוסה, ואיך את מנגנון הפעולה של עופרת מעכב ייזום שעתוק רומן ניתן לקבוע.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכל היצורים, שעתוק הוא תהליך מוסדר בחוזקה. מבחני שעתוק במבחנה פותחו כדי לספק פלטפורמה לבדיקת ההשפעות של גורמי שעתוק, מולקולות קטנות ומעכבי שעתוק. במאמר בשיטה זו, assay שעתוק חיידקים כללי תוארה. מבחני תמלול בשילוב עם ג'ל אלקטרופורזה רצף של תמלילים חשובים מאוד…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
- Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
- Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
- Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
- Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
- Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
- Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
- Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
- Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
- Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
- Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
- Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
- Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
- Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
- Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
- Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
- Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
- Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
- Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).
