इन विट्रो प्रतिलेखन Assays और दवाओं की खोज में अपने आवेदन
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
इन विट्रो प्रतिलेखन assays विकसित किया गया है और व्यापक रूप से आणविक प्रतिलेखन में शामिल तंत्र का अध्ययन करने के लिए कई वर्षों के लिए इस्तेमाल किया। इस प्रक्रिया को बहु सबयूनिट डीएनए निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ (RNAP) और प्रतिलेखन कारक है कि जीन की अभिव्यक्ति के दौरान RNAP की गतिविधि को व्यवस्थित करने के लिए कार्य की एक श्रृंखला की आवश्यकता है। radiolabeled टेप की अनुक्रमण जेल वैद्युतकणसंचलन पैरामीटर क्या यह प्रभावित कर सकते हैं कि कैसे प्रतिलेखन आय और के बारे में विस्तृत जानकारी यंत्रवत प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस पत्र में हम अध्ययन करने के लिए कैसे आवश्यक बढ़ाव कारक नुसा ट्रांसक्रिप्शनल रोक, साथ ही एक जीवाणुरोधी एजेंट RNAP holoenzyme गठन के निषेध के माध्यम से प्रतिलेखन दीक्षा को निशाना बनाने की पहचान करने के लिए एक विधि को नियंत्रित प्रोटोकॉल का वर्णन। इन विधियों प्रतिलेखन कारक की कार्रवाई की व्यवस्था है जो अभी भी अस्पष्ट रहते हैं, साथ ही नए जीवाणुरोधी एजेंसियों का पता लगाने के लिए अतिरिक्त दृष्टिकोण के विकास के लिए मंच के रूप में एक प्रयोग किया जा सकताटीएस को निशाना प्रतिलेखन जो एंटीबायोटिक अनुसंधान और विकास में एक underutilized दवा लक्ष्य है।
Introduction
ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया है जिसमें शाही सेना एक विशिष्ट डीएनए टेम्पलेट से संश्लेषित है। कोशिकाओं में तीन अलग RNAPs देखते हैं: RNAP मैं rRNA व्यापारियों transcribes, RNAP द्वितीय mRNA और कुछ छोटे परमाणु आरएनए के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार है, और 5 एस rRNA और tRNA के संश्लेषण RNAP III द्वारा किया जाता है। बैक्टीरिया में, वहाँ केवल एक RNAP शाही सेना के सभी वर्गों के प्रतिलेखन के लिए जिम्मेदार है। दीक्षा, बढ़ाव और समाप्ति: वहाँ प्रतिलेखन के तीन चरण हैं। ट्रांसक्रिप्शन सेल में सबसे उच्च विनियमित प्रक्रियाओं में से एक है। प्रतिलेखन चक्र में प्रत्येक चरण में जीन अभिव्यक्ति 1 के नियमन के लिए एक जांच की चौकी का प्रतिनिधित्व करता है। दीक्षा के लिए, RNAP एक सिग्मा कारक के साथ संबद्ध करने के लिए holoenzyme फार्म के लिए है, जो विशिष्ट साइटों के लिए एंजाइम को निर्देशित करने के लिए आवश्यक है एक खुला प्रमोटर जटिल प्रपत्र प्रमोटरों 2 आह्वान किया है। बाद में, प्रतिलेखन कारक के एक बड़े सूट विनियमन ओ के लिए जिम्मेदार हैंबढ़ाव और समाप्ति चरणों के दौरान एफ RNAP गतिविधियों। प्रतिलेखन कारक यहां जांच की अत्यधिक संरक्षित और आवश्यक प्रोटीन, नुसा है। यह rRNA संश्लेषण 3-5 दौरान प्रतिलेखन रोक और समाप्ति, साथ ही विरोधी समाप्ति को विनियमित करने में शामिल है।
इन विट्रो प्रतिलेखन assays प्रतिलेखन 6 दौरान जटिल विनियामक कदमों का अध्ययन करने के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में विकसित किया गया है। सामान्य में, एक प्रमोटर क्षेत्र सहित डीएनए के एक रेखीय टुकड़ा प्रतिलेखन के लिए टेम्पलेट के रूप में आवश्यक है। डीएनए टेम्पलेट आमतौर पर पीसीआर द्वारा या एक प्लाज्मिड linearizing से उत्पन्न होता है। शुद्ध प्रोटीन और NTPS (पता लगाने के प्रयोजनों के लिए एक radiolabeled एनटीपी सहित) तो जोड़ रहे हैं और उत्पाद ऊष्मायन के लिए जरूरी अवधि के बाद का विश्लेषण किया। उचित टेम्पलेट्स और प्रतिक्रिया की स्थिति का उपयोग करना, प्रतिलेखन के सभी चरणों के इस दृष्टिकोण है जो transcr की विस्तृत आणविक लक्षण वर्णन के लिए सक्षम है का उपयोग कर जांच की गई हैपिछली आधी सदी से अधिक 7 iption। RNAP के 3-आयामी संरचना के बारे में जानकारी के साथ संयोजन में यह भी संभव हो गया है एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीबायोटिक सुराग द्वारा प्रतिलेखन निषेध की आणविक तंत्र की जांच, और नए, बेहतर दवाओं 8-10 के विकास में इस जानकारी का उपयोग करने के लिए।
इस काम में हम कैसे प्रतिलेखन assays प्रतिलेखन बढ़ाव / समाप्ति कारक नुसा, और कैसे एक उपन्यास प्रतिलेखन दीक्षा अवरोध नेतृत्व की कार्रवाई की व्यवस्था निर्धारित किया जा सकता द्वारा विनियमन की व्यवस्था का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उदाहरण देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सभी जीवों में, प्रतिलेखन एक कसकर विनियमित प्रक्रिया है। इन विट्रो प्रतिलेखन assays प्रतिलेखन कारक, छोटे अणुओं और प्रतिलेखन अवरोधकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक मंच प्रदान करने के लिए विकसित कि…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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