Summary

in vitro転写アッセイおよび創薬への応用

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Abstract

インビトロ転写アッセイが開発され、広く転写に関与する分子メカニズムを研究するために長年使用します。このプロセスは、マルチサブユニットのDNA依存性RNAポリメラーゼ(RNAP)遺伝子発現時RNAPの活性を調節するように作用する転写因子のシリーズを必要とします。放射性標識された転写物の配列決定ゲル電気泳動は、それに影響を与えることができる方法の転写が進行するとどのようなパラメータの詳細な機構的情報を提供するために使用されます。本稿では、本質的な伸長因子ヌサは、転写一時停止、ならびにRNAPホロ酵素形成の阻害を介して転写開始をターゲットに抗菌剤を同定する方法を調整する方法を研究するためのプロトコルについて説明します。これらの方法は、まだ不明である転写因子の作用機序を調査するための追加の方法、ならびに新規な抗菌アーガンを開発するためのプラットフォームとして使用することができますtsが、抗生物質の研究開発における遊休薬物標的である転写をターゲットに。

Introduction

転写は、RNAは、特定のDNA鋳型から合成する処理です。真核細胞では三つの異なるRNAPsありますRNAP私はrRNAの前駆体を転写は、RNAP IIは、mRNAおよび特定小核RNAの合成のために責任がある、と5SのrRNAとtRNAの合成は、RNAP IIIによって行われます。細菌では、RNAのすべてのクラスの転写を担当する唯一のRNAPがあります。開始、伸長および終結:転写の3つの段階があります。転写は、細胞の中で最も高度に調節プロセスの一つです。 転写サイクルの各ステージは、遺伝子発現1の調節のためのチェックポイントを表します。開始のため、RNAPはオープンプロモーター複合体を形成するために、プロモーター2と呼ばれる特定の部位に酵素を誘導するように要求される、ホロ酵素を形成するためにシグマ因子に関連付けるました。続いて、転写因子の大きなスイートは、規制Oを担当しています伸びと終了フェーズ時にf RNAP活動。ここで調べた転写因子は、ヌサ高度に保存された必須タンパク質です。これは、rRNAの合成3-5の間に転写停止および終了、ならびに抗終結の調節に関与しています。

インビトロ転写アッセイは転写6時の複雑な規制の手順を研究するための強力なツールとして開発されてきました。一般的に、プロモーター領域を含むDNAの線状断片は、転写のテンプレートとして必要とされます。 DNAテンプレートは、通常、PCRによって、またはプラスミドを線形化することによって生成されます。 (検出目的のための1つの放射性標識NTPを含む)、精製されたタンパク質とのNTPを添加すると、生成物は、インキュベーションの必要な期間の後に分析しました。適切なテンプレートおよび反応条件を使用して、転写のすべての段階はtranscrの詳細な分子特性解析を可能にしたこのアプローチを用いて検討されています最後の半世紀7オーバーiption。 RNAPの3次元構造に関する情報と組み合わせて、また、抗生物質および抗生物質のリードによる転写抑制の分子機構を精査し、新しい、改善された薬物8-10の開発にこの情報を使用することが可能でした。

本研究で、我々は、転写アッセイ転写伸長/終結因子ヌサによる調節のメカニズムを決定するために使用できる方法の例を提供する方法、および新規な転写開始阻害、リードの作用機序を決定することができます。

Protocol

注意:実験は、放射性同位元素32 Pの使用を含む、すべての適切な安全条件が満たされるまで何も作業が行われるべきではありません。一般職員は、安全コースに参加し、前に放射性試薬を用いた実験に教師の練習を受けることが必要です。反応を行う際に個人用保護機器着用してください(熱ルミネッセンス線量計、安全眼鏡、手袋、放射線室の白衣、完全長ズボンを、靴、つま先を閉じました)?…

Representative Results

転写効率は、異なる時点でバンドの放射線のレベルを測定することによって決定することができます。ヌサ係数有効ポーズの可視化、終了、および実行オフ製品( 図1A)の機能をテストするために一時停止アッセイ。 (ヌサNTD、アミノ酸残基1-137)ヌサのN末端ドメインの存在下では、RNA生成物の外観は著しくヌサを欠く対照実験と比較して遅れていまし?…

Discussion

全ての生物において、転写は厳密に制御プロセスである。 インビトロ転写アッセイ転写因子、小分子および転写阻害剤の効果を試験するためのプラットフォームを提供するために開発されてきました。この方法の論文では、一般的な細菌の転写のためのアッセイを説明しました。彼らはタイムラインに沿ってすべての転写産物の可視化を可能として転写産物の配列決定ゲル電気泳動と…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Materials

Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)  Sigma-Aldrich  T9281
N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

References

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Cite This Article
Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

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