시험 관내 전사 분석 실험 및 약물 발견에의 응용
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
시험 관내 전사 분석법이 개발되어 널리 전사에 관여하는 분자 메커니즘을 연구하기 위해 수년 동안 사용된다. 이 프로세스는 다중 서브 유니트 DNA 의존성 RNA 폴리머 라제 (RNAP) 유전자 발현시 RNAP의 활성을 조절하는 작용을하는 전사 인자의 연속을 필요로한다. 방사성 표지 성적 시퀀싱 겔 전기 영동이란 파라미터를 미치는 영향 전사 진행하여 기계적 상세한 정보를 제공하기 위해 사용된다. 본 논문에서는 필수 연장 인자는 전사 누사 일시뿐만 아니라 RNAP 완전 효소 형성의 억제를 통해 전사 개시 타겟팅 항균제를 식별하는 방법을 조절하는 방법을 연구하는 프로토콜을 기술한다. 이 방법은 아직 불분명 남아있는 전사 인자의 작용 메커니즘뿐만 아니라 새로운 항균 카발라을 탐구하는 추가 방법의 개발을위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다TS는 항생제 연구 개발의 활용도가 낮은 약물 표적 인 전사를 대상으로.
Introduction
RNA 전사는 특정 DNA를 주형으로 합성되는 과정이다. 진핵 세포에서 세 가지 RNAPs있다 : RNAP 내가 rRNA의 전구체 사본을 만듭니다가, RNAP II는 mRNA의 특정 작은 핵 RNA를 합성에 대한 책임이며, 5S rRNA의와의 tRNA의 합성은 RNAP III에 의해 수행된다. 박테리아에서, RNA의 모든 클래스의 전사에 대한 책임 하나만 RNAP있다. 개시, 신장 및 종료 : 전사의 세 단계가 있습니다. 전사는 셀의 가장 높은 조정 프로세스이다. 전사주기의 각 단계는 하나의 유전자 발현의 조절에 대한 검사를 나타낸다. 개시 내용 RNAP 오픈 프로모터 복합체를 형성 촉진제 2라고 특정 사이트에 효소를 유도 할 필요가있는 완전 효소 형성 시그마 인자와 연관이있다. 그 후, 전사 인자의 넓은 스위트 룸은 규제 오에 대한 책임이 있습니다신장 및 종료 단계에서 F RNAP 활동. 여기서 조사 전사 인자는 누사 고도로 보존 필수적인 단백질이다. 이것은 rRNA의 합성 3-5 중에 전사 일시 정지 및 종료뿐만 아니라 항 – 종단 조절에 관여한다.
시험 관내에서 전사 분석은 전사 6시 복잡한 규제 단계를 연구하는 강력한 도구로 개발되었다. 일반적으로, 프로모터 영역을 포함하는 DNA의 단편은 선형 전사 주형으로 요구된다. DNA를 템플릿은 일반적으로 PCR에 의해 또는 플라스미드를 선형화에 의해 생성된다. 정제 된 단백질 (검출을 위해 하나의 방사성 NTP 포함) NTPS을 첨가하고 생성물을 배양 필요한 기간 후의 분석된다. 적절한 템플릿과 반응 조건을 사용하여, 전사의 모든 단계는 transcr의 상세한 분자 특성을 활성화 한이 접근법을 사용하여 검사 된지난 반세기 이상 7 iption. RNAP의 3 차원 구조에 대한 정보와 함께 또한 항생제 항생제 리드에 의해 전사 억제의 분자 메커니즘을 조사하고, 새롭게 개선 된 약제 8-10의 개발에이 정보를 사용할 수있다.
본 연구에서 우리는 전사 분석법 전사 신장 / 종료 인자 누사 방법 및 신규 한 전사 개시 저해 리드의 작용 메카니즘이 결정될 수에 의해 규제기구를 결정하는 데 사용될 수있는 방법의 예를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 생물에서 전사가 단단히 통제 프로세스이다. 전사 분석법이 전사 인자, 작은 분자의 전사 억제제의 효과를 테스트하기위한 플랫폼을 제공하기 위해 개발 된 시험 관내. 이 방법 논문에서는 일반 세균 전사에 대한 분석은 설명했다. 그들은 타임 라인을 따라 모든 전사 제품의 시각화를 허용하는 성적 증명서의 순서 겔 전기 영동과 결합 전사 분석은 기계적인 연구에 매우 중요하다. 결?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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