Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery
Summary
In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.
Abstract
Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos e amplamente utilizados durante muitos anos para estudar os mecanismos moleculares envolvidos na transcrição. Este processo requer múltiplas subunidades de polimerase de ADN dependente de ARN (RNAP) e uma série de factores de transcrição que actuam para modular a actividade de RNAP durante a expressão do gene. eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos radiomarcados é usado para fornecer informações mecanicista detalhadas sobre como rendimentos de transcrição e quais parâmetros podem afetá-lo. Neste artigo descrevemos o protocolo para estudar como o factor de alongamento essencial NusA regula a pausa de transcrição, bem como um método para identificar um agente antibacteriano alvo de iniciação de transcrição através da inibição da formação holoenzyme RNAP. Estes métodos podem ser usados como uma plataforma para o desenvolvimento de abordagens adicionais para explorar o mecanismo de acção dos factores de transcrição que ainda permanecem incertos, bem como novos agen antibacterianats alvo de transcrição que é um alvo da droga subutilizados em pesquisa e desenvolvimento de antibióticos.
Introduction
A transcrição é o processo em que o ARN é sintetizado a partir de um molde de ADN específica. Em células eucariotas, existem três RNAPs distintas: eu RNAP transcreve precursores de rRNA, RNAP II é responsável pela síntese de ARNm e de certos RNAs nucleares pequenos, e a síntese de rRNA 5S e tRNA é realizada por RNAP III. Em bactérias, existe apenas uma RNAP responsável pela transcrição de todas as classes de ARN. Existem três fases de transcrição: iniciação, alongamento e terminação. A transcrição é um dos processos mais altamente reguladas na célula. Cada etapa do ciclo de transcrição representa um ponto de verificação para a regulação da expressão do gene 1. Para a iniciação, RNAP tem de se associar com um factor sigma para formar holoenzima, o que é necessário para dirigir a enzima para locais específicos chamados promotores de 2 para formar um complexo promotor aberta. Posteriormente, um grande conjunto de fatores de transcrição são responsáveis pela regulação oatividades f RNAP durante as fases de alongamento e terminação. O fator de transcrição aqui examinado é a proteína altamente conservada e essencial, Nusa. Ele está envolvido na regulação da transcrição e a pausa de terminação, bem como anti-terminação durante a síntese de rRNA 3-5.
Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos como poderosas ferramentas para estudar os passos de regulação complexos durante a transcrição 6. Em geral, um fragmento linear de ADN incluindo uma região promotora é necessária como molde para a transcrição. O molde de ADN é normalmente gerado por PCR ou por linearização um plasmídeo. proteínas e os NTP (incluindo uma NTP marcado radioactivamente para fins de detecção) purificados são então adicionados e produto analisado a seguir ao período de incubação necessário. Usando modelos apropriados e condições de reacção, todas as etapas de transcrição foram examinadas utilizando esta abordagem, o que permitiu a caracterização molecular detalhada da transcription ao longo do último meio século 7. Em combinação com a informação sobre a estrutura 3-dimensional da RNAP Também foi possível investigar o mecanismo molecular da inibição da transcrição pelos antibióticos e conduz a antibióticos, e utilizar essa informação para o desenvolvimento de novas e melhores drogas 8-10.
Neste trabalho fornecem exemplos de como ensaios de transcrição pode ser usada para determinar o mecanismo de regulação da transcrição por alongamento / factor de terminação NusA, e a forma como o mecanismo de acção de um inibidor da ligação de iniciação da transcrição podem ser determinados novos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em todos os organismos, a transcrição é um processo fortemente regulado. Os ensaios in vitro de transcrição têm sido desenvolvidos para proporcionar uma plataforma para testar os efeitos de factores de transcrição, moléculas pequenas e inibidores da transcrição. Neste trabalho método, foi descrito um ensaio para a transcrição bacteriana geral. ensaios de transcrição combinados com eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos são muito importantes para estudos sobre os mecanismo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).
Materials
| Obtain the proteins required for transcription assay | |||
| E. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Preparation of DEPC-treated water | |||
| diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNase-free water | |||
| Ambion Nuclease-Free Water | ThermoFisher | AM9937 | |
| DNA template preparation | |||
| Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR primers | |||
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 fluorospectrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Preparation | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldrich | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| High Purity rNTPs | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | Radioactive compound |
| RNA ladder preparation | |||
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gel preparation | |||
| Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Aldrich | 154563 | |
| boric acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamide/bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transcription Assay | |||
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transcription buffer | |||
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filter paper | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioactive decontaminant | |||
| Decon 90 | decon | decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
References
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