Summary

İn Vitro Transkripsiyon Tahliller ve İlaç Keşfi Onların Uygulama

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Abstract

In vitro transkripsiyon analizleri geliştirilmiştir ve yaygın transkripsiyon rol oynayan moleküler mekanizmaları incelemek için yıllardır kullanılmaktadır. Bu işlem, çok-alt-birim DNA-bağımlı RNA polimeraz (rnap) ve gen ekspresyonu ne rnap aktivitesini modüle için harekete transkripsiyon faktörlerinin bir dizi gereklidir. radyoaktif işaretli transkript dizileme jel elektroforezi hangi parametreler bunu nasıl etkilediğini transkripsiyon ilerler ve ayrıntılı mekanistik bilgi vermek için kullanılır. Bu yazıda, esas uzama faktörü nusa transkripsiyonel duraklatma olarak rnap holoenzyme oluşumunun inhibisyonu yoluyla transkripsiyon inisiyasyon hedefleme bir antibakteriyel ajanı tanımlamak için bir yöntem düzenler nasıl çalışma protokol açıklar. Bu yöntemler de tam olarak bilinmemektedir transkripsiyon faktörlerinin etki mekanizması, aynı zamanda, yeni antibakteriyel agen keşfetmek için ilave yaklaşımlar geliştirilmesi için platform olarak kullanılabilirts antibiyotik araştırma ve geliştirme bir atıl ilaç hedefi olan transkripsiyonu hedefleyen.

Introduction

Transkripsiyon, RNA, belirli bir DNA şablonu sentez edildiği bir süreçtir. Ökaryotik hücrelerde üç farklı RNAPs vardır: rnap I rRNA öncüllerini transkripsiyonun rnap II mRNA ve bazı küçük nükleer RNA sentezi için sorumludur ve 5S rRNA ve tRNA sentezi rnap III ile gerçekleştirilir. bakteri, RNA, tüm sınıfları transkripsiyon sorumlu tek bir rnap vardır. başlatma, uzama ve sonlanma: transkripsiyon üç aşaması vardır. Transkripsiyon hücrede en çok düzenlenen süreçlerden biridir. Transkripsiyon döngüsünde Her aşamada gen ifadesinin 1 düzenlenmesi için bir kontrol noktasını temsil eder. Başlatılması için, rnap açık hızlandırıcı kompleks oluşturmak için yükselticiler 2 olarak adlandırılan belirli sitelere enzimi doğrudan gerekli olan, holoenzyme oluşturmak üzere bir sigma faktörü ile bağlanması gerekir. Daha sonra, transkripsiyon faktörleri büyük bir paketi düzenleme o sorumluduruzama ve sonlanma aşamalarında f rnap faaliyetleri. Burada incelenen transkripsiyon faktörü, nusa iyi muhafaza edilen ve temel bir proteindir. Bu rRNA sentezi 3-5 esnasında transkripsiyon duraklatma ve sonlandırma, ve anti-sonlandırma düzenlenmesinde rol oynar.

In vitro transkripsiyon deneyleri transkripsiyon 6 sırasında karmaşık düzenleyici adımlar incelemek için güçlü araçlar olarak geliştirilmiştir. Genel olarak, bir uyarıcı bölge içeren DNA doğrusal fragmanı transkripsiyonu için, şablon olarak gereklidir. DNA şablonu, genellikle PCR ile ya da bir plasmid doğrusallaştırılmış tarafından oluşturulur. Arıtılmış proteinler ve (algılama amaçlı bir radyoetiketlenmiş NTP dahil) NTP'ler eklenmiş ve ürün inkübasyon gerekli dönemini takip eden analiz edilmektedir. uygun şablonları ve reaksiyon koşullan kullanılarak, transkripsiyon tüm aşamaları TRANSCR ayrıntılı moleküler karakterizasyonu sağladı, bu yaklaşım kullanılarak incelenmiştirSon yarım yüzyıl 7 üzerinde iption. Rnap 3-boyutlu yapısı ile ilgili bilgi ile birlikte de antibiyotik ve antibiyotik potansiyel transkripsiyon inhibisyonu moleküler mekanizması prob, ve yeni, iyileştirilmiş ilaç 8-10 geliştirilmesinde bu bilgileri kullanmak mümkün olmuştur.

Bu çalışmada, transkripsiyon deneyleri transkripsiyon uzama / sonlandırma faktörü Nusa ve nasıl yeni bir transkripsiyon başlatma inhibitörü kurşun etki mekanizması tespit edilebilir tarafından düzenlenmesi mekanizmasını belirlemek için nasıl kullanılabileceği örnekler sunmak.

Protocol

Dikkat: Deneyler radyoaktif izotop 32 P kullanımını içerir ve tüm uygun güvenlik koşulları sağlanana kadar hiçbir çalışma yapılmalıdır. Genellikle personel güvenlik kursuna katılmak ve önceki radyoaktif reaktifler kullanılarak deneylere denetimli uygulama geçmesi gerekmektedir. reaksiyonu yaparken kişisel koruyucu donanımları giyiniz (termolüminesans dozimetre, koruyucu gözlük, eldiven, radyasyon odası laboratuvar mont, tam uzunlukta pantolon, ayakkabı-ayak kapalı). Deney 1…

Representative Results

Transkripsiyon verimi, farklı zaman noktalarında bantlarında radyasyon seviyesini ölçmek suretiyle belirlenebilir. Duraklatma tahlil duraklama, fesih görselleştirme etkin Nusa faktörü işlevi sınamak ve run-off ürünler (Şekil 1A) için. (Nusa NTD, amino asit kalıntıları 1-137) nusa N-terminal alanının varlığında, RNA ürünlerinin görünümünü önemli ölçüde nusa yoksun olan kontrol deneyi ile karşılaştırıldığında gecikmiştir. amino as…

Discussion

Bütün organizmalarda, transkripsiyon bir sıkı regüle süreçtir. Transkripsiyon analizleri transkripsiyon faktörleri, küçük moleküller ve transkripsiyon inhibitörlerinin etkilerini test etmek için bir platform sağlamak için geliştirilmiştir in vitro. Bu yöntem, bir kağıt, genel bakteriyel transkripsiyon için bir tahlil tanımlanmıştır. Onlar bir zaman çizgisi boyunca tüm transkripsiyon ürünlerinin görselleştirme izin olarak transkript dizi jel elektroforezi ile kombine transkripsiyo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Materials

Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)  Sigma-Aldrich  T9281
N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

References

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).

Play Video

Cite This Article
Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

View Video