폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

Summary

우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문​​ 지식을 줄일 수 있습니다.

Abstract

인공 지질 이중층 또는 검은 지질 막 (BLM), 이온 채널 단백질의 상호 작용을 연구뿐만 아니라 바이오 센서 응용 프로그램을위한 강력한 도구입니다. 그러나, 기존의 BLM 형성 기술은 몇 가지 단점을 가지고 있고 그들은 종종 특정 전문 지식과 힘든 과정을 필요로한다. 특히, 기존의 BLMs 낮은 형성 성공률과 일치하지 않는 막 형성 시간을 겪는다. 여기서는, 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 통상적으로 사용되는 필름 (폴리 테트라 플루오로 에틸렌, 폴리 옥시 메틸렌, 폴리스티렌)로 대체함으로써 조절 시닝 아웃 향상된 BLM 생성율 함께 보유하고 수송 BLM 형성 시스템을 보여준다. 이 실험에서는, 예컨대 PDMS 박막 등의 다공질 구조 중합체가 사용된다. 저점도 통상적으로 사용되는 용매는 대조적으로 또, 스쿠알렌의 사용은 막의 수명을 연장, PDMS에 의해 천천히 용매의 흡수를 통해 제어 시닝 아웃 시간을 허용. 광고에서시 조건은 스쿠알렌과 헥사 데칸의 혼합물을 사용함으로써, 지질 용액의 빙점 무기한 저장되고 용이하게 운반 할 수 있고, 전구체 막을 제작했다 이외에 (~ 16 ° C)를 증가시켰다. 이러한 막 전구체는 <1 시간 BLM의 형성 시간을 단축하고 80 % ~ BLM의 형성 속도를 달성했다. 또한, 그래미시 딘 A의 이온 채널 실험 멤브레인 시스템의 타당성을 입증 하였다.

Introduction

인공 지질 이중층 막 또는 블랙 지질막 (BLM)은 세포막 및 이온 채널의 메카니즘을 해명뿐만 아니라 이온 채널 이온 / 분자간 상호 작용을 이해하기위한 중요한 도구이다. 패치 - 클램프 방법이지만 ^1-7 종종 세포막 연구 금 표준을 고려하고,이 힘든이고, 이온 채널 측정 숙련 된 작업자를 필요로한다. ⁸ 인위적 재구성 지질 이중층 막 이온 채널 연구 대체 공구로 부상하고 있지만, ^9,10-들은 또한 수고와 연관된 프로세스 및 특정 전문 지식. 또한, 막은 기계적 교란에 취약하다. 따라서, 현재까지 도입 지질 이중층 기술은 제한된 실제 적용. ⁽¹¹⁾

지질 이중층 막, 카스텔 외. ⁽¹²⁾ 및 IDE와 야나기의 안정성과 수명을 향상시키기 위해서 ^{13 하이드로 겔에 의해 지원되는 독립 지질 이중층을 고안 하였다. 그러나 향상된 수명에도 불구하고 (<24 시간), 이중층 견고성이 향상되지 않았다. 전 등. 14 (몇 일까지) 강화 장수의 결과로, 친밀한 하이드로 겔 지질 이중층 연락처와 하이드로 겔 캡슐 막 (HEM)을 고안했다. 더 HEM의 수명을 증가시키기 위해, Malmstadt....}

Protocol

1. 솔루션 준비

1. 버퍼 용액의 제조 :
   1. 버퍼 용액을 공식화 한 M의 KCl (염화칼륨), 10mM의 트리스 -HCl (트리스 - 히드로 클로라이드), 증류수에 1 mM의 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)을 용해하고 8.0의 pH를 조정한다.
   2. 0.20 μm의 필터를 사용하여 상기 용액을 필터. 살균, 15 분 동안 121 ° C에서 상기 용액을 오토 클레이브.
2. 프리 페인팅 지질 용액의 제조 :
   1. (w : v)로 DPhPC (1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3- 포스파티딜콜린) 지질 사전 페인팅 지질 용액 제형이 3 %를 용해 (2)의 혼합물에 8 N -decane 및 헥사 (V : V). 회 전자를 사용하여 밤새 교반.
3. 막 형성 지질 용액의 제조 :
   1. 0.1 % DPhPC (1,2- diphytanoyl- SN -glycero -3- 포스파티딜콜린) 지질을 용해, 막 형성 지질 용액을 공식화 (W : V) 2의 혼합물에 8 평방ualene와 헥사 (V : V). 회 전자를 사용하여 밤새 교반.

Results

MPES 솔루션 구성의 최적화
지질 용매의 조성이 다른 성공적 MPES에서 지질 이중층 막을 재구성 시험 하였다. DPhPC ¹⁴ 3 %를 함유하는 N- 헥사 데칸의 혼합물과의 MP 시스템 제막 (~ 27 %)의 낮은 성공률을 나타내었다. PDMS의 막이 연속적 지질 용액을 추출한 또한, 본래 지질 이중층 막을 유지하는 용매 조성물을 최적화 할 필요가 있었다. 스쿠알렌 사용한 경우 20 ° C. ^(19)에서 0.92 (Cp)의 점도를 갖는 대신 N- 데칸 사용한 C ¹⁸ 20 ℃에서 12 (Cp)의 점도 따라서, 스쿠알렌, 안정성 및 수명 모두가로 인해 증가 PDMS에 의해 용매 흡수의 감소 속도는. 표 1은 다른 용매 조성 막의 얇아 아웃 시간, 수명 및 성공률을 비교합니다.

Discussion

당사의 BLM 형성 기술은 산업적 사용 가능성이 제한적인 기존 기술과 달리 세포막 및 이온 채널 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다. PDMS 박막을 이용한 멤브레인 전구체를 개발하고, 신속한 자가조립이 가능한 냉동막 전구체를 고안하였다.

막 형성이 필름과 지질 용액 사이의 표면 상호 작용을 통해서만 발생하는 소수성 필름을 사용한 기존의 막 형성 방법과 달리,²⁰ PDMS 필름의 막 얇아짐은 표면 상호 작용 및 PDMS 필름에 의한 용매 추출을 통해 발생합니다. PDMS 박막 표면을 따라 용매 습윤뿐만 아니라 PDMS의 기공으로의 용매 흡수는 지질 이중층의 빠르고 일관된 형성을 촉진했습니다. 또한 점도가 높은 스쿠알렌과 어는점이 높은 헥사데칸의 조합으로 막 형성 시간을 제어할 수 있었습니다. 이 시스템을 통해 BLM 형성 성공률(< 80%)을 높이는 동시에 막 형성 시간(< 40분)을 줄일 수 있었습니다. 어는점이 높은 용매를 사용했기 때문에 멤브레인 전구체.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
염화칼	Sigma-Aldrich	P9333	: 완충 용액
용 Tris-hydrochloride	Sigma-Aldrich	1185-53-1	완충 용액
용 Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	60-00-4	완충 용액
n< / em>-decane	용 Sigma-Aldrich	44074-U	지질 용액 용
Hexadecane	Sigma-Aldrich	544-76-3	지질 용액
용 Squalene	Sigma-Aldrich	S3626	지질 용액
Gramicidin A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	막 단백질
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	membrae 대형을 위해
Sylgard 184a와 184b elastromer 장비	다우 코닝 아시아		PDMS 박막
0.2를 생성하기 위하여; m 필터	Satorius stedim	16534----------K	완충액을 필터링하려면
Rotator	FinePCR	AG	지질을 균일하게 용해
Autoclave	Biofree	BF-60AC	완충액을 살균하려면
Spin coater	Shinu Mst	SP-60P	PDMS 프리폴리머를 퍼뜨리기 위해
진공 데시케이터	Welch	2042-22	기포를 제거하려면 PDMS 프리폴리머
500 μ 엠  punch	Harris Uni-Core	0.5	PDMS 박막 CNC 기계에 조리개를 만들려면
	SME	거래 SME 2518	멤브레인 형성 챔버를 제작하려면
할로겐 광섬유 조명기	Motic	MLC-150C	광학 관찰을 위해 PDMS 박막의 조리개를 조명하려면
디지털 현미경 디지털	블루	QX-5	지질 이중층 멤브레인을 광학적으로 관찰합니다. 형성
전극	A-M 시스템		막 형성을 전기적으로 관찰하기 위해
미세 전극 증폭기 (Axopatch 증폭기)	Axon Instruments	Axopatch 200B 증폭기	멤브레인의 커패시턴스를 측정하기 위해 (원고에서 미세 전극 증폭기로 설명됨)