تنفيذ نظام متماسك مكافحة ستوكس رامان نثر (CARS) على تي: الياقوت وOPO بالليزر القائم ستاندرد الليزر الضوئي مجهر
Summary
متماسك مكافحة ستوكس رامان نثر (CARS) المجهري بناء على الاهتزاز الأصيل من السندات جزيء يسمح التسمية خالية انتقائية كيميائيا تصوير الخلايا الحية. يعرض هذا العمل على تنفيذ تقنية المجهر التكميلية على multiphoton الليزر مجهر المسح المعياري بناء على الفيمتو ثانية تي: ليزر الياقوت والليزر OPO.
Abstract
أصبحت ليزر الياقوت والبصرية مذبذب حدودي (OPO) لتكرار خط ليزر متاحة للعلماء الأحياء: المجاهر ليزر المسح الجمع بين الفيمتو ثانية تي. تم تصميم هذه الأنظمة في المقام الأول لمتعدد القنوات ثنائي الفوتون مضان المجهر. ومع ذلك، من دون أي تعديل، مكملا المجهر الضوئي غير الخطية مثل ثاني التوافقي جيل (SHG) أو الجيل الثالث التوافقي (تي إتش جي) ويمكن أيضا أن يؤديها مع هذا الإعداد، مما يسمح التصوير التسمية خالية من جزيئات منظم أو متوسطة مائي واجهات الدهون. هذه التقنيات هي مناسبة تماما للمراقبة في الجسم الحي، لكنها محدودة في خصوصية الكيميائية. كيميائيا التصوير الانتقائي يمكن الحصول عليها من إشارات الاهتزاز الكامنة على أساس تشتت رامان. يوفر متحد البؤر رامان المجهر القرار المكانية 3D، ولكنه يتطلب متوسط القوة العالية واكتساب الوقت الطويل. للتغلب على هذه الصعوبات، قد سمحت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الليزر جمعةاإلمنائية من غير الخطية المجهر الذبذبات الضوئية، ولا سيما متماسك مكافحة ستوكس رامان نثر (CARS). ولذلك فقد ظهرت سيارات المجهر كأداة قوية لتصوير الخلايا البيولوجية والحية، من خلال نسبة الدهون في رسم الخرائط كيميائيا (عن طريق الاهتزاز CH تمتد)، والمياه (عن طريق الاهتزازات تمتد OH)، البروتينات أو الحمض النووي. في هذا العمل، وصفنا تنفيذ تقنية السيارات على يقترن OPO القياسية multiphoton الليزر مجهر المسح. لأنه يقوم على التزامن في الوقت المناسب من خطوط الليزر اثنين عن طريق ضبط طول واحد من مسار شعاع الليزر. نقدم تنفيذ خطوة بخطوة من هذه التقنية على نظام multiphoton القائمة. خلفية أساسية في مجال البصريات التجريبية مفيدة ولا يتطلب نظام عرض المعدات التكميلية باهظة الثمن. نحن لتوضيح أيضا CARS تصوير الحصول على الأغماد المايلين العصب الوركي من القوارض، وتبين لنا أن هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع التصوير الضوئي غير الخطية الأخرى، مثل تي القياسيةالتعليم الجامعي الفوتون تقنية مضان وتوليد التوافقي الثاني.
Introduction
أصبح المجهر الضوئي تقنية كبيرة لرؤية تدميري من العمليات الحيوية في الكائنات النظم البيولوجية مع قرار التحت خلوية. مضان المجهر حاليا على النقيض التصوير الأكثر شعبية المستخدمة في الخلايا الحية نظرا لخصوصيته عالية وحساسية 1. وقد ظهرت لوحة كبيرة من تحقيقات الفلورسنت (الأصباغ الخارجية والبروتينات المشفرة وراثيا، النانوية أشباه الموصلات). وقد ازدهرت مختلف عينة الإضاءة التقنيات التي تعتمد الفلورسنت (مثل المجهر متحد البؤر أو اثنين الفوتون) لإجراء التصوير 3D وللحد من العيب الرئيسي لهذا الأسلوب الذي photobleaching من 2. وتشمل القيود الأخرى شرط وضع العلامات fluorophore لأن معظم الأنواع الجزيئية ليست الفلورسنت جوهريا، وبالتالي هذه fluorophores يتعين عرضه بشكل مصطنع في العينة المصورة. قد يكون هذا التلاعب الاصطناعي التخريبية خاصة بالنسبة للجزيئات صغيرة أو يحرض عاءential الصور سمية. هذه الأسباب تجعل مضان المجهر ليس مناسبة تماما لالمجراة في عمليات الرصد. وبالتالي، فإن استخدام تقنيات التصوير البصرية مع حساسية عالية والتناقضات الجزيئية محددة دون استخدام جزيئات الفلورسنت مرغوب فيه للغاية في العلوم الطبية الحيوية.
ظهرت عدة تقنيات التصوير البصرية اللاخطية دون وضع العلامات أو تلطيخ، بما في ذلك الجيل الثاني التوافقي (SHG) 3،4 والجيل الثالث التوافقي (THG) 5. وقد استخدمت مجموعات المساعدة الذاتية المجهر إلى الترتيبات الهيكلية صورة على مستوى supramolecular مثل الأنابيب الدقيقة أو الكولاجين 6. يتم إنشاء THG من التغاير البصرية مثل واجهة بين وسط مائي والدهون (7). وقد تجلى THG أيضا إلى صورة المايلين 8،9. وفي كلتا الطريقتين يمكن تنفيذها على مضان المجهر ثنائي الفوتون وتتطلب شعاع ليزر واحد فقط. ومع ذلك فإنها تتطلب كثافة الليزر عالية الطاقة (عادة 50ميغاواط في 860 نانومتر للمجموعات المساعدة الذاتية 10، 25 – 50 ميغاواط في 1180 نانومتر لTHG 9)، والتي هي ضارة في عينات المعيشة، وليس لتوفير خصوصية الكيميائية المطلوبة للا لبس فيه صورة الهياكل البيولوجية المحددة.
كيميائيا التصوير الانتقائي يمكن الحصول عليها من المتأصلة إشارات اهتزاز الجزيئية على أساس تشتت رامان. عندما شعاع من ضوء يضرب المسألة، الفوتونات يمكن استيعابها ومتناثرة من الذرات أو الجزيئات. ومعظم الفوتونات المنتشرة لها نفس الطاقة، أي تردد، كما الفوتونات الحادث. وتسمى هذه العملية نثر رايلي. ومع ذلك، سوف تكون مبعثرة عدد قليل من الفوتونات في تردد بصري يختلف عن تردد الفوتونات الحادث، أي مع عملية نثر غير مرن دعا رامان نثر. الفرق في الطاقة تأتي من الإثارة وسائط الذبذبات اعتمادا على التركيب الجزيئي والبيئة. لذلك، رامان عفوية نثر الأقليمايديس التصوير انتقائية كيميائيا كما الجزيئات المختلفة لها ترددات الذبذبات محددة. ومع ذلك فإنه محدود بسبب اشارة ضعيفة للغاية. وقد تم تطوير متحد البؤر رامان المجهري ويوفر القرار المكانية 3D، ولكنه يتطلب ارتفاع متوسط السلطة والاستحواذ وقت طويل لل11. للتغلب على هذه الصعوبات، وقد سمحت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الليزر صعود غير الخطية المجهر الذبذبات الضوئية، ولا سيما متماسك نثر المضادة للستوكس رامان (CARS) 11،12،13.
السيارات هي ثالث ترتيب عملية البصرية اللاخطية. ثلاثة أشعة الليزر، ويتألف من شعاع مضخة في تردد ω P، وتركز شعاع ستوكس في تردد ω S وشعاع مسبار (وهي في معظم الأحيان مضخة) في عينة وتوليد شعاع مكافحة ستوكس في تردد ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. إشارة المضادة للستوكس يمكن أن تتعزز بشكل كبير عندما يكون الفرق ترددبين المضخة وستوكس الحزم يتم ضبطها لرامان الجزيئي الاهتزاز Ω R = (ω ف – ω S). ويستند إشارة سيارات على تفاعل الفوتون متعددة. وبالتالي فإنه يولد أوامر إشارة متماسكة من حجم أقوى من تشتت رامان عفوية.
وقد تجلى CARS المجهر لأول مرة بشكل تجريبي من قبل دنكان وآخرون. 15. تسومبوش آخرون تحسين ثم هذه التقنية، وباستخدام اثنين تركز بالقرب من الأشعة تحت الحمراء أشعة الليزر الفيمتو ثانية مع عدسة الهدف من الفتحة العددية العالية، مما يتيح للمرحلة حالة مطابقة السيارات وتجنب ثنائي الفوتون غير الرنانة الخلفية 16. ولذلك فقد ظهرت سيارات المجهر كأداة قوية ليعيش الخلايا والأنسجة والتصوير، عن طريق الكشف كيميائيا جزيئات مثل الدهون (عن طريق الاهتزاز CH تمتد) 17،18 والمياه (عن طريق الاهتزازات تمتد OH)، والبروتينات، الحمض النووي في الخلايا الحية 19،20 ولكن أيضا بالديوتيريوم مركب كيميائيالصورة للصناعات الدوائية 21 وتطبيقات التجميل 22.
فإن القيود الرئيسية من المجهري غير الخطية تنبع من تعقيد وتكلفة من المصادر الضوئية. يتطلب نظام السيارتين الليزر الطول الموجي الانضباطي مع فترات نبض قصيرة ومع القطارات نبض متزامنة زمنيا ومكانيا. واستندت السيارات في وقت مبكر المجاهر على اثنين بيكو ثانية متزامنة تي: ليزر الياقوت 20. تم الحصول CARS التصوير أيضا من واحد الفيمتو ثانية تي: ليزر الياقوت توليد مصدر الضوء supercontinuum 23. في الآونة الأخيرة، ومصادر الليزر تتكون من واحد الفيمتو ثانية تي: لقد تم استخدام ليزر الياقوت ضخ مؤشرات التذبذب حدودي البصرية الانضباطي (OPO) للسيارات المجهر. هذا الإعداد يسمح جوهريا مزامنة مؤقتا الحزم مع فرق من التردد بين المضخة وشعاع ستوكس تغطي كامل طيف الذبذبات الجزيئي 24. وبالإضافة إلى ذلك، المجاهر المسح بالليزر على أساس turn-تتوفر الآن لعدم الفيزياء مفتاح ليزر خ م وOPO، وتستخدم في المقام الأول لمدة الفوتون مضان (مدفوعات نهاية الخدمة). إمكانات هذه مجموعة عمليات يمكن أن تتعزز بشكل كبير دون الحاجة إلى استثمارات تكميلية عن طريق دمج الآخرين التصوير الضوئي غير الخطية، لأن كل الخطية (NLO) التصوير طريقة حساسة للهياكل أو جزيئات محددة. لذا المتعدد الوسائط NLO التصوير تستفيد من إمكانات NLO المجهري لعينات بيولوجية معقدة 25. وقد سمح للاقتران من هذه التقنيات في تحقيق العديد من الأسئلة الحيوية، ولا سيما على ايض الدهون والجلد أو سرطان تطوير 26، والهيكل العظمي تنمية العضلات 27، آفات تصلب الشرايين 28. وعلاوة على ذلك، فإن تنفيذ شعاع الليزر المسح الضوئي مع CARS يعطي القدرة على التصوير ارتفاع معدل، أي أداة جذابة لدراسة العمليات الديناميكية في الجسم الحي.
والهدف من هذا العمل هو إظهار كل خطوة لتنفيذ رتقنية انه CARS على multiphoton الليزر مجهر المسح القياسية. ويستند المجهر على تي fsec: ليزر الياقوت وOPO (التي تضخها تي: ليزر الياقوت) التي تديرها برنامج لعلماء الأحياء. تم تنفيذ التكامل عن طريق ضبط طول واحد من مسار شعاع الليزر من أجل مزامنة في الوقت شعاعين. وصفنا تنفيذ خطوة بخطوة من هذا الأسلوب الذي يتطلب الخلفية الأساسية فقط في مجال البصريات التجريبية. نحن لتوضيح أيضا CARS التصوير الحصول على الأغماد المايلين العصب الوركي من القوارض، ونظهر هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها في وقت واحد مع الآخرين التصوير الضوئي غير الخطية، مثل تقنية مضان ثنائي الفوتون القياسية والجيل الثاني التوافقي.
Protocol
Representative Results
Discussion
أصعب جزء من هذا العمل هو التزامن الزمني للأشعة الليزر. فإنه يتطلب الضوئي السريع جنبا إلى جنب مع الذبذبات السريعة، ولكن فقط تداخل الخام في وقت لا يمكن أن يؤديها في البداية. ثم هناك حاجة إلى مزيد من التعديل من عدد قليل سم. وأخيرا، والتحركات ميكرومتر من مرحلة الترجمة الخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
