La mise en œuvre d'un système anti-Stokes cohérente Raman Scattering (CARS) sur un Ti: saphir et microscope à balayage laser OPO Based Laser Standard

Summary

Coherent diffusion anti-Stokes Raman (CARS) microscopie basée sur les vibrations inhérentes de liaisons moléculaires permet chimiquement sélective imagerie des cellules vivantes sans étiquette. Ce travail présente la mise en œuvre d'une technique de microscopie complémentaire sur un microscope à balayage laser multiphotonique standard basé sur un Ti femtoseconde: laser saphir et un laser OPO.

Abstract

microscopes à balayage laser combinant un Ti femtoseconde: laser saphir et un oscillateur paramétrique optique (OPO) pour dupliquer la ligne laser sont devenus disponibles pour les biologistes. Ces systèmes sont conçus principalement pour multivoie microscopie par fluorescence à deux photons. Cependant, sans aucune modification, la microscopie optique non linéaire complémentaire comme deuxième génération de l'harmonique (SHG) ou troisième génération harmonique (THG) peut également être effectuée avec ce set-up, ce qui permet l'imagerie sans étiquette de molécules structurées ou moyen aqueuse les interfaces lipidiques. Ces techniques sont bien adaptés à l' observation in vivo, mais sont limités dans la spécificité chimique. Chimiquement imagerie sélective peut être obtenue à partir de signaux de vibrations inhérentes basées sur la diffusion Raman. Confocale microscopie Raman offre une résolution spatiale en 3D, mais il nécessite une puissance moyenne élevée et de longue durée d'acquisition. Pour surmonter ces difficultés, les progrès récents dans la technologie laser ont permis l'develloppement de la microscopie non linéaire de vibration optique, en particulier anti-Stokes cohérente de diffusion Raman (CARS). Microscopie CARS a donc émergé comme un outil puissant pour l'imagerie cellulaire biologique et en direct, par les lipides de cartographie chimique (par vibration CH stretch), l'eau (via OH vibrations d'étirement), des protéines ou de l'ADN. Dans ce travail, nous décrivons la mise en œuvre de la technique CARS sur un balayage laser multiphotonique microscope OPO couplé standard. Elle est basée sur la synchronisation dans le temps des deux lignes laser en ajustant la longueur de l'un du trajet du faisceau laser. Nous présentons une mise en œuvre étape par étape de cette technique sur un système multiphotonique existant. Une formation de base en optique expérimentale est utile et le système présenté ne nécessite aucun équipement supplémentaire coûteux. Nous illustrons également CARS imagerie obtenus sur les gaines de myéline de nerf sciatique de rongeur, et nous montrons que cette imagerie peut être réalisée simultanément avec d'autres imagerie optique non linéaire, telle que la norme two-photon technique de fluorescence et de génération de seconde harmonique.

Introduction

La microscopie optique est devenue une technique importante pour la visualisation non destructive de processus dynamiques dans des systèmes biologiques vivants avec une résolution subcellulaire. La microscopie à fluorescence est actuellement le contraste d'imagerie le plus populaire utilisé dans les cellules vivantes en raison de sa haute spécificité et la sensibilité ^1. Une large palette de sondes fluorescentes a émergé (colorants exogènes, les protéines codées génétiquement, des nanoparticules de semi-conducteurs). Diverses techniques fluorescentes à base illumination de l' échantillon ont fleuri (telles que la microscopie confocale ou à deux photons) pour effectuer l' imagerie 3D et de réduire un inconvénient principal de cette technique qui est photoblanchiment ^2. D'autres limitations comprennent l'exigence de l'étiquetage fluorophore parce que la plupart des espèces moléculaires ne sont pas intrinsèquement fluorescent et par conséquent, ces fluorophores doivent être introduits artificiellement dans l'échantillon imagé. Cette manipulation artificielle peut être perturbatrice, en particulier pour les petites molécules ou induit potphoto-toxicité tiel. Ces raisons font microscopie par fluorescence ne conviennent pas pour les observations in vivo. Par conséquent, l'utilisation de techniques d'imagerie optique à haute sensibilité et contrastes moléculaires spécifiques sans l'utilisation de molécules fluorescentes est hautement souhaitable dans la science biomédicale.

Plusieurs techniques d'imagerie optique non linéaire sans étiquetage ou la coloration ont émergé, y compris la deuxième génération de l' harmonique (SHG) ^3,4 et troisième génération harmonique (THG) ^5. SHG microscopie a été utilisée pour l' image des arrangements structurels au niveau supramoléculaire tels que les microtubules ou le collagène ^6. THG est généré à partir hétérogénéités optiques tels que l' interface entre un milieu aqueux et les lipides ^7. THG a également été démontrée à l' image de la myéline ^8,9. Les deux techniques peuvent être mises en oeuvre sur un microscope à fluorescence à deux photons et ne nécessitent qu'un seul faisceau laser. Cependant, ils nécessitent l'intensité du laser de puissance élevée (typiquement 50mW à 860 nm pour SHG ^10, 25 – 50 mW à 1180 nm pour THG ^9), qui est délétère dans des échantillons de vie, et ne fournit pas la spécificité chimique qui est nécessaire pour clairement l' image de structures biologiques spécifiques.

Chimiquement imagerie sélective peut être obtenue à partir des signaux de vibration moléculaire inhérentes basées sur la diffusion Raman. Lorsqu'un faisceau de lumière frappe la matière, les photons peuvent être absorbés et dispersés par des atomes ou des molécules. La plupart des photons diffusés auront la même énergie, à savoir la fréquence, que les photons incidents. Ce processus est appelé diffusion Rayleigh. Cependant, un petit nombre de photons seront dispersées à une fréquence optique différente de la fréquence des photons incidents, à savoir, avec un processus de diffusion inélastique appelé diffusion Raman. La différence d'énergie provient d'une excitation des modes de vibration en fonction de la structure moléculaire et l'environnement. Par conséquent, Raman spontanée diffusion provides d'imagerie chimique sélective des molécules différentes ont des fréquences vibratoires spécifiques. Toutefois, il est limité en raison de son signal extrêmement faible. Confocale microscopie Raman a été développé et fournit une résolution spatiale en 3D, mais il nécessite une puissance moyenne élevée et à long temps d' acquisition ^11. Pour surmonter ces difficultés, les progrès récents dans la technologie laser ont permis la montée de la microscopie non linéaire de vibration optique, en particulier la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS) ^11,12,13.

CARS est un processus optique non linéaire du troisième ordre. Trois faisceaux laser, composé d'un faisceau de pompage à la fréquence ω _P, un faisceau Stokes à la fréquence ω _S et un faisceau de sonde (étant le plus souvent la pompe) sont concentrés dans un échantillon et de générer un faisceau anti-Stokes à la fréquence de _AS = ( 2ω _P – ω _S) ^14. Le signal anti-Stokes peut être considérablement améliorée lorsque la différence de fréquenceentre la pompe et les faisceaux de Stokes est accordé à une vibration moléculaire Raman Ω _R = (ω _P – ω _S). le signal CARS est basé sur l'interaction de photons multiples. Il génère donc un ordre de signaux cohérents de grandeur plus forte que la diffusion Raman spontanée.

Microscopie CARS a été démontré expérimentalement par Duncan et al. ^15. Zumbusch et al. , Améliore alors la technique, en utilisant deux concentrés dans le proche infrarouge des faisceaux laser femtoseconde avec une lentille d' objectif à grande ouverture numérique, permettant la mise en correspondance l' état ​​de phase de CARS , et en évitant les deux photons non résonante fond ^16. Microscopie CARS a donc émergé comme un outil puissant pour l' imagerie cellulaire et les tissus vivants, en détectant chimiquement des molécules telles que les lipides (par vibration CH stretch) ^17,18, l' eau (via OH vibrations d'étirement), les protéines, l' ADN dans les cellules vivantes ^19,20 mais aussi deutéré composé chimiques pour les produits pharmaceutiques et cosmétiques ^{21 22.}

La principale limitation de la microscopie non linéaire provient de la complexité et le coût des sources optiques. Un système de CARS nécessite deux lasers de longueur d'onde accordables avec de courtes durées d'impulsion et avec des trains d'impulsions temporellement et spatialement synchronisés. Les premiers microscopes CARS reposaient sur ​​deux picoseconde synchronisée Ti: saphir lasers ^20. CARS imagerie a également été obtenue à partir d' un seul femtoseconde Ti: laser saphir générer une source de lumière supercontinuum ^23. Récemment, des sources laser composées d'un seul femtoseconde Ti: laser saphir pompage d'un oscillateur paramétrique optique accordable (OPO) ont été utilisés pour la microscopie CARS. Cette configuration permet intrinsèquement temporellement synchronisée des faisceaux avec une différence de fréquence entre la pompe et le faisceau Stokes couvrant le spectre de vibration moléculaire complète ^24. En outre, les microscopes à balayage laser basé sur un chiffre d'affaireslaser touche fs et une OPO, principalement utilisé pour la fluorescence à deux photons (TPF) sont maintenant disponibles pour les non-physiciens. Le potentiel de ces set-up peut être grandement améliorée sans nécessiter des investissements supplémentaires par l'incorporation d'autres techniques d'imagerie optique non linéaire, puisque chaque non linéaire (NLO) modalité d'imagerie est sensible à des structures ou des molécules spécifiques. Imagerie multimodaux NLO capitalise donc le potentiel de NLO microscopie pour des échantillons biologiques complexes ^25. Le couplage de ces techniques a permis à l'enquête sur de nombreuses questions biologiques, en particulier sur le métabolisme des lipides, la peau ou le cancer du développement ^26, le développement du muscle squelettique ^27, les lésions athéroscléreuses ^28. En outre, la mise en œuvre de balayage par faisceau laser avec CARS donne la capacité d'imagerie à haut débit, à savoir, un outil attrayant pour étudier les processus dynamiques in vivo.

Le but de ce travail est de montrer chaque étape pour mettre en œuvre ttechnique il CARS sur un microscope à balayage laser multiphotonique standard. Le microscope est basé sur un alliage Ti fs: laser à saphir et un OPO (pompé par le Ti: saphir laser) commandé par un logiciel pour les biologistes. L'intégration a été réalisée en ajustant la longueur de l'une de la trajectoire du faisceau laser afin de synchroniser dans le temps les deux faisceaux. Nous décrivons la mise en oeuvre étape par étape de cette technique qui ne nécessite qu'une formation de base en optique expérimentale. Nous illustrons également CARS imagerie obtenus sur les gaines de myéline du nerf sciatique des rongeurs, et nous montrons cette imagerie peut être réalisée simultanément avec d'autres imagerie optique non linéaire, comme technique de fluorescence à deux photons standard et la deuxième génération de l'harmonique.

Protocol

Figure 1. Vue schématique du général set-up Il comprend le Ti:. Saphir (680 – 1,080 nm) et l'OPO (1.050 – 1.300 nm) lasers, la ligne à retard avec les 4 miroirs (M 1 à M 4), l'oscilloscope rapide, la photodiode et deux iris fixes diaphragmes I 1 et I 2. Un miroir M 2 et M 3 sont fixés sur une platine de t…

Representative Results

La fréquence de la norme Ti de train d'impulsions: laser saphir est généralement autour de 80 MHz. Le BOA a la même fréquence, car il est pompé par le Ti: saphir laser. Un oscilloscope rapide d'au moins 200 MHz est donc nécessaire. Une photodiode rapide dans la gamme de 600 à 1100 nm est également nécessaire. Le décalage temporel maximal se produit lorsque le Ti: saphir et les signaux OPO sont décalés de 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6.2 nanosecondes. Il c…

Discussion

La partie la plus difficile du travail est la synchronisation temporelle des faisceaux laser. Elle exige une photodiode rapide combiné avec un oscilloscope rapide, mais seulement un chevauchement rugueux dans le temps peut être réalisée dans un premier temps. Ensuite, un ajustement supplémentaire de quelques cm est nécessaire. Enfin, micromètre se déplace d'une platine de translation linéaire permet d'effectuer le réglage fin final de la longueur de la ligne de retard afin de déclencher le signal CARS…

Materials

Oscilloscope	Tektronix	TDS 520D	500 MHz
Photodetector	Thorlabs	DET08C/M, T4290	5 GHz InGaAs, 800-1700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II	Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family	APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP	Carl Zeiss
Motorized periscope	Newport
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0	Carl Zeiss
Beam combiner	Carl Zeiss
Acousto-optic modulator	Carl Zeiss
OPO power attenuator	Carl Zeiss
Photomultiplier tube	Carl Zeiss
ZEN software	Carl Zeiss
Bandpass filters	Carl Zeiss	LSM BiG 1935-176	400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm
Dichroic mirror	Carl Zeiss		Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors	Newport	10D20ER.2	λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer	Thorlabs	PT1/M	Quantity 1
Aluminium breadboard	Thorlabs	MB1015/M	Quantity 1
Mirror mount	Thorlabs	KMSS/M	Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics	Thorlabs	MH25	Quantity 4
Iris diaphragms	Thorlabs	ID8/M	Quantity 3
Protective box	Thorlabs	TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S	Quantity 1
Optical posts	Thorlabs	TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M	Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661-690 nm bandpass filter	Semrock	676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter	Quantity 1
Fluorescent beads	ThermoFisher	TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card	Thorlabs		IR laser viewing card
Laser safety glass	Newport	LV-F22.P5L07
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain	ThermoFisher	F34652