Umsetzung einer kohärenten Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)-System auf einem Ti: Saphir und OPO-Laser-basierte Standard-Laser-Scanning-Mikroskop

Summary

Coherent Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS) Mikroskopie auf Basis von Eigenschwingung von Molekül Bindungen erlaubt die markierungsfreie chemisch selektive Live Cell Imaging. Diese Arbeit stellt die Implementierung einer komplementären Mikroskopietechnik auf einem Standard-Multiphotonen-Laserrastermikroskop auf Basis eines Femtosekunden- Ti: Saphir-Laser und einem OPO-Laser.

Abstract

Laser-Scanning-Mikroskope ein Femtosekunden Ti kombiniert: Saphir-Laser und ein optischer parametrischer Oszillator (OPO), um die Laserlinie zu duplizieren sind für Biologen zur Verfügung stehen. Diese Systeme werden hauptsächlich für Mehrkanal-Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskopie. Jedoch ohne jegliche Modifikation, komplementäre nichtlineare optische Mikroskopie wie Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) oder Erzeugung der dritten Harmonischen (THG) kann auch mit diesem Set-up durchgeführt werden, so dass die markierungsfreie Abbildung von strukturierten Molekülen oder wässrigen mittel- Lipid-Grenzflächen. Diese Techniken sind gut geeignet für die in-vivo – Beobachtung, sondern sind in der chemischen Spezifität beschränkt. Chemisch selektive Bildgebung kann aus inhärente Schwingungssignale auf Basis von Raman-Streuung erhalten werden. Die konfokale Raman-Mikroskopie liefert räumliche 3D-Auflösung, aber es erfordert eine hohe mittlere Leistung und lange Aufnahmezeit. Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten, die jüngsten Fortschritte in der Lasertechnik die Entwick erlaubtwicklung von nichtlinearen optischen Schwingungsmikroskopie, insbesondere kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS). daher CARS-Mikroskopie hat sich als ein mächtiges Werkzeug für die biologische und Live Cell Imaging, durch chemisch-Mapping Lipide (über CH-Streckschwingung), Wasser (über OH-Streckschwingungen), Proteine ​​oder DNA. In dieser Arbeit beschreiben wir die Umsetzung der CARS-Technik auf einem Standard-OPO-gekoppelten Multi Laser-Scanning-Mikroskop. Es basiert auf dem in Zeitsynchronisation der beiden Laserlinien, die durch die Länge von einer der Laserstrahlpfad eingestellt wird. Wir stellen eine Schritt-für-Schritt-Implementierung dieser Technik auf einem bestehenden Multisystem. Eine grundlegende Hintergrund in der experimentellen Optik ist hilfreich, und das vorgestellte System keine teuren Zusatzausstattung erforderlich. Wir zeigen auch, CARS Abbilden auf Myelinscheiden der Ischiasnerv von Nagetier erhalten, und wir zeigen, dass diese Abbildungs ​​gleichzeitig mit anderen nichtlinearen optischen Abbildungsdurchgeführt werden kann, wie beispielsweise Standard-two-Photonen-Fluoreszenz-Technik und Erzeugung der zweiten Harmonischen.

Introduction

Optische Mikroskopie hat in lebenden biologischen Systemen mit subzellulärer Auflösung eine wichtige Technik zur zerstörungsfreien Visualisierung dynamischer Prozesse geworden. Die Fluoreszenzmikroskopie ist derzeit der beliebteste Bildgebungskontrast in lebenden Zellen verwendet aufgrund seiner hohen Spezifität und Sensitivität ^1. Eine große Palette von Fluoreszenzsonden entstanden (exogene Farbstoffe, genetisch kodierten Proteine, Halbleiter-Nanopartikel). Verschiedene Probenbeleuchtung Fluoreszenzgestützte Techniken blühten haben (wie konfokaler oder Zweiphotonenmikroskopie) 3D – Bildgebung durchzuführen und einen Hauptnachteil dieser Technik zu verringern , die ² Photobleaching. Weitere Einschränkungen sind das Erfordernis der Markierungsfluorophor, weil die meisten molekularen Spezies sind nicht eigen fluoreszierende und daher sind diese Fluorophore müssen künstlich in der abgebildeten Probe eingeführt werden. Diese künstliche Manipulation kann störend sein, vor allem für kleine Moleküle oder Topf induziertzielle Phototoxizität. Diese Gründe machen Fluoreszenzmikroskopie nicht gut geeignet für die In-vivo – Beobachtungen. Daher ist die Verwendung von optischen Abbildungstechniken mit hoher Empfindlichkeit und spezifische molekulare Kontraste ohne die Verwendung von Fluoreszenzmolekülen äußerst wünschenswert, in der biomedizinischen Wissenschaft.

Mehrere nichtlineare optische Bildgebungsverfahren ohne Kennzeichnung oder Färbung entstanden, einschließlich Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) ^3,4 und der dritten Harmonischen (THG) ^5. SHG – Mikroskopie wurde an Bild strukturelle Anordnungen auf supramolekularer Ebene wie Mikrotubuli oder Kollagen ⁶ verwendet. THG erzeugt aus optischen Heterogenitäten wie Schnittstelle zwischen einem wässrigen Medium und Lipiden ^7. THG wurde auch auf Bild Myelin ^8,9 demonstriert. Beide Techniken können auf einem Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskop und erfordern nur einen Laserstrahl durchgeführt werden. Allerdings erfordern sie hohe Leistung Laserintensität (in der Regel 50mW bei 860 nm für SHG ^10, 25 – 50 mW bei 1,180 nm für THG ^9), die in lebenden Proben schädlich ist, und zwar um die chemische Spezifität nicht liefern, die eindeutig Bild spezifische biologische Strukturen erforderlich ist.

Chemisch selektive Bildgebung kann von inhärenten molekularen Schwingungssignale auf Basis von Raman-Streuung erhalten werden. Wenn ein Lichtstrahl Materie auftrifft, können Photonen, die von Atomen oder Molekülen absorbiert und gestreut werden. Die meisten der gestreuten Photonen die gleiche Energie haben, das heißt, die Frequenz, wie die einfallenden Photonen. Dieser Vorgang wird als Rayleigh-Streuung genannt. Bezeichnet die Raman – Streuung eine geringe Anzahl von Photonen wird jedoch mit einem unelastischen Streuprozeß unterscheidet sich von der Frequenz der einfallenden Photonen, dh bei einer optischen Frequenz gestreut. Der Unterschied in der Energie stammt aus Anregung von Schwingungsmoden auf molekularen Struktur und Umgebung abhängt. Daher spontane Raman-Streuung provchemisch selektive Iden Bildgebung wie verschiedene Moleküle haben spezifische Schwingungsfrequenzen. Jedoch ist es wegen der extrem schwachen Signals begrenzt. Die konfokale Raman – Mikroskopie wurde entwickelt und bietet räumliche 3D – Auflösung, aber es erfordert eine hohe mittlere Leistung und lange Aufnahmezeit ^11. Zur Überwindung dieser Schwierigkeiten, die jüngsten Fortschritte in der Lasertechnologie der Anstieg der nicht – linearen optischen Schwingungs Mikroskopie erlaubt, insbesondere kohärente Anti-Stokes – Raman – Streuung (CARS) ^11,12,13.

CARS ist ein dritter Ordnung nichtlinearen optischen Prozess. Drei Laserstrahlen, bestehend aus einem Pumpstrahl bei der Frequenz ω _P, ein Stokes – Strahl bei der Frequenz ω _S und einen Sondenstrahl (meistens ist die Pumpe) in einer Probe fokussiert und erzeugen eine Anti-Stokes – Strahl bei der Frequenz ω _AS = ( 2ω _P – ω _S) ^14. Der Anti-Stokes-Signal kann wesentlich verbessert werden, wenn die Frequenzdifferenzzwischen der Pumpe und der Stokes – Strahlen auf eine Raman molekulare Schwingung Ω _R = abgestimmt ist (ω _P – ω _S). CARS-Signal wird auf mehreren Photon-Wechselwirkung basiert. Es erzeugt daher ein kohärentes Signal Größenordnungen stärker als spontane Raman-Streuung.

CARS – Mikroskopie wurde erstmals experimentell durch Duncan et al. ^15. Zumbusch et al. Verbessert dann die Technik, durch Verwendung von zwei fokussierten Nahinfrarot-Femtosekundenlaserstrahlung mit einer Objektivlinse mit hoher numerischer Apertur, so dass die Phasenanpassungsbedingung von PKW und vermeidet die Zwei-Photonen nicht-resonanten Hintergrund ^16. Daher CARS – Mikroskopie hat sich als ein mächtiges Werkzeug für die lebenden Zellen und Gewebe – Bildgebung, die durch chemische Moleküle wie Lipide (über CH – Streckschwingung) ^17,18, Wasser (über OH – Streckschwingungen) Nachweis, Proteine, DNA in lebenden Zellen ^19,20 sondern auch chemische Verbindung deuteriertems für pharmazeutische und kosmetische Anwendungen ^{21 22.}

Die Hauptbeschränkung der nichtlinearen Mikroskopie stammt von der Kompliziertheit und die Kosten der optischen Quellen. Ein CARS System erfordert zwei Wellenlänge durchstimmbare Laser mit kurzen Pulsdauern und mit zeitlich und räumlich synchronisierte Impulsfolgen. Frühe CARS Mikroskope wurden auf Basis von zwei synchronisierten Pikosekunden – Ti: Saphir – Laser ^20. Saphir – Laser zum Erzeugen eines Superkontinuum- Lichtquelle ^23: CARS Bildgebung wurde ebenfalls aus einem einzigen Femtosekunden Ti erhalten. Vor kurzem zusammengesetzt Laserquellen eines einzelnen Femtosekunden Ti: Saphir-Laser eine abstimmbare optische parametrische Oszillatoren (OPO) Pumpen wurden für die CARS-Mikroskopie verwendet. Dieser Aufbau ermöglicht eigen zeitlich synchronisierten Strahlen mit einer Differenz von Frequenz zwischen der Pumpe und dem Stokes – Strahl die das gesamte molekulare Schwingungsspektrum ^24. Darüber hinaus Laser-Scanning-Mikroskope auf der Basis eines Dreh-Schlüssel fs-Laser und ein OPO, in erster Linie für die Zwei-Photonen-Fluoreszenz (TPF) verwendet werden, sind jetzt nicht die Physiker zur Verfügung. Das Potential solcher Aufbauten können erheblich, ohne Ergänzungsanlage durch den Einbau von anderen nichtlinearen optischen Abbildungs ​​verbessert werden, da jede nichtlineare (NLO) Bildgebungsmodalität zu spezifischen Strukturen oder Molekülen empfindlich ist. Multimodale NLO – Bildgebung nutzt daher das Potenzial von NLO – Mikroskopie für komplexe biologische Proben ^25. Die Kopplung dieser Techniken hat die Untersuchung vieler biologischer Fragestellungen erlaubt, insbesondere auf Fettstoffwechsels, Haut oder Krebsentwicklung ^26, Entwicklung Skelettmuskel ^27, atherosklerotische Läsionen ^28. Darüber hinaus gibt die Implementierung von Laserstrahlabtastung mit CARS die Fähigkeit , mit hoher Rate Bildgebung, dh ein ansprechendes Werkzeug dynamische Prozesse in vivo zu untersuchen.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, jeden Schritt zu zeigen, t zu implementierener CARS Technik auf einem Standard-Multi Laser-Scanning-Mikroskop. Das Mikroskop wird basierend auf einem fsec Ti: Saphir-Laser und ein OPO (vom Ti gepumpt: Laser Saphir) für Biologen durch eine Software betrieben. Die Integration wurde durch Einstellen der Länge von einer der Laserstrahlpfad, um in der Zeit, die zwei Strahlen zu synchronisieren ausgeführt. Wir beschreiben die Schritt-für-Schritt Durchführung dieser Technik, die nur grundlegende Hintergrund in experimentellen Optik erfordert. Wir zeigen auch CARS auf Myelinscheiden von Ischiasnerv von Nagetieren gewonnen Bildgebung, und wir zeigen diese Bildgebung können mit anderen nichtlinearen optischen Bildgebung, wie Standard-Zwei-Photonen-Fluoreszenz-Technik und Erzeugung der zweiten Harmonischen gleichzeitig ausgeführt werden.

Protocol

Abbildung 1. Schematische Darstellung des allgemeinen Aufbaus Es umfasst die Ti:. Saphir (680 – 1.080 nm) und die OPO (1050 – 1300 nm) Laser, die Verzögerungsleitung mit den vier Spiegeln (M 1 bis M 4), das schnelle Oszilloskop, die Photodiode und zwei feste Irisblenden I 1 und I 2. Spiegel M 2 und M 3 werden auf e…

Representative Results

Die Pulsfolgefrequenz von Standard-Ti: Saphir-Laser ist in der Regel etwa 80 MHz. Der OPO hat die gleiche Frequenz, da es durch die Ti gepumpt wird: Saphir-Laser. Ein schnelles Oszilloskop von mindestens 200 MHz ist daher erforderlich. Eine schnelle Photodiode im Bereich von 600 bis 1.100 nm ist ebenfalls erforderlich. Die maximale zeitliche Verschiebung tritt auf, wenn die Ti: Saphir und die OPO – Signale von 1 / (2 × 80 × 10 6) = 6,2 ns verschoben sind. Es entspricht…

Discussion

Der schwierigste Teil der Arbeit ist die zeitliche Synchronisation der Laserstrahlen. Es erfordert eine schnelle Photodiode mit einem schnellen Oszilloskop kombiniert, aber nur eine grobe zeitlich überlappend auf den ersten durchgeführt werden. Dann wird eine weitere Einstellung von wenigen cm erforderlich. Schließlich Mikrometer bewegt sich durch eine lineare Translationsstufe ermöglicht die Durchführung der endgültigen Feineinstellung der Verzögerungsleitungslänge, um die CARS-Signal auszulösen. Dieses Signal…

Materials

Oscilloscope	Tektronix	TDS 520D	500 MHz
Photodetector	Thorlabs	DET08C/M, T4290	5 GHz InGaAs, 800-1700 nm
Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II	Coherent
Optical parametric oscillator OPO Compact Family	APE Berlin
Axio Examiner microscope LSM 7 MP	Carl Zeiss
Motorized periscope	Newport
Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0	Carl Zeiss
Beam combiner	Carl Zeiss
Acousto-optic modulator	Carl Zeiss
OPO power attenuator	Carl Zeiss
Photomultiplier tube	Carl Zeiss
ZEN software	Carl Zeiss
Bandpass filters	Carl Zeiss	LSM BiG 1935-176	400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm
Dichroic mirror	Carl Zeiss		Cutoff wavelength 760 nm
Silver mirrors	Newport	10D20ER.2	λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4
Single-axis translation stage with standard micrometer	Thorlabs	PT1/M	Quantity 1
Aluminium breadboard	Thorlabs	MB1015/M	Quantity 1
Mirror mount	Thorlabs	KMSS/M	Quantity 4
Mirror holder for Ø1" Optics	Thorlabs	MH25	Quantity 4
Iris diaphragms	Thorlabs	ID8/M	Quantity 3
Protective box	Thorlabs	TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S	Quantity 1
Optical posts	Thorlabs	TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M	Quantity 8 (lengths depending on the set-up)
661-690 nm bandpass filter	Semrock	676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter	Quantity 1
Fluorescent beads	ThermoFisher	TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit
Laser viewing card	Thorlabs		IR laser viewing card
Laser safety glass	Newport	LV-F22.P5L07
FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain	ThermoFisher	F34652