Implementazione di un sistema coerente anti-Stokes Raman Scattering (CARS) su un Ti: zaffiro e OPO laser basata su standard Laser Scanning Microscope
Summary
Coherent dispersione anti-Stokes Raman (CARS) microscopia a base di vibrazione intrinseca di obbligazioni molecola permette chimicamente selettivo imaging cellulare dal vivo senza etichetta. Questo lavoro presenta l'implementazione di una tecnica di microscopia complementare su un microscopio a scansione laser multifotone standard basato su un femtosecondi laser Ti: zaffiro ed un laser OPO.
Abstract
La scansione laser microscopi conciliano un femtosecondi laser Ti: zaffiro e un ottica oscillatore parametrico (OPO) per duplicare la linea laser si sono resi disponibili per i biologi. Questi sistemi sono progettati principalmente per microscopia di fluorescenza a due fotoni multicanale. Tuttavia, senza alcuna modifica, complementare microscopia ottica non lineare come seconda armonica generazione (SHG) o terza generazione armonica (THG) può essere eseguita anche con questo set-up, permettendo l'imaging libera-label di molecole strutturate o medio acquosa interfacce di lipidi. Queste tecniche sono adatti per l'osservazione in vivo, ma sono limitate in specificità chimica. Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione intrinseche basate su Raman. Confocale microscopia Raman fornisce una risoluzione spaziale in 3D, ma richiede elevata potenza media e tempo di acquisizione a lungo. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso lo sviluppo della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente anti-Stokes scattering Raman (CARS). CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l'imaging cellulare biologica e dal vivo, da lipidi chimicamente mappatura (attraverso la vibrazione CH tratto), acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine o DNA. In questo lavoro, si descrive l'applicazione della tecnica di automobili su un microscopio a scansione laser multifotonica OPO-accoppiato di serie. Essa si basa sulla sincronizzazione nel tempo delle due linee laser regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser. Presentiamo un'implementazione passo-passo di questa tecnica su un sistema multiphoton esistente. Un fondo di base ottica sperimentale è disponibile e il sistema presentato non richiede attrezzature supplementari costose. Illustriamo anche CARS di imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e dimostriamo che questa immagini può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio t di seriewo-photon tecnica a fluorescenza e la generazione di seconda armonica.
Introduction
La microscopia ottica è diventata una tecnica importante per la visualizzazione non distruttiva dei processi dinamici nei sistemi biologici viventi con una risoluzione sub-cellulare. Microscopia a fluorescenza è attualmente il contrasto delle immagini più popolare usato in cellule vive per la sua elevata specificità e sensibilità 1. Una grande tavolozza di sonde fluorescenti è emerso (coloranti esogeni, proteine geneticamente codificate, nanoparticelle di semiconduttori). Varie tecniche fluorescenti a base di illuminazione del campione sono fiorite (ad esempio la microscopia confocale o due fotoni) per eseguire l'imaging 3D e ridurre un inconveniente principale di questa tecnica che viene photobleaching 2. Altre limitazioni includono il requisito di etichettatura fluoroforo perché la maggior parte delle specie molecolari non sono intrinsecamente fluorescenti e quindi questi fluorofori essere introdotto artificialmente nel campione esaminato. Questa manipolazione artificiale può essere dirompente soprattutto per le piccole molecole o induce pentolaziale foto-tossicità. Queste ragioni rendono la fluorescenza non microscopia adatto per vivo in-osservazioni. Quindi, l'uso di tecniche di imaging ottico con elevata sensibilità e contrasto molecolari specifici senza l'uso di molecole fluorescenti è altamente auspicabile nella scienza biomedica.
Diverse tecniche di imaging ottici non lineari senza etichettatura o colorazione sono emersi, tra seconda armonica generazione (SHG) 3,4 e la generazione di terza armonica (THG) 5. SHG microscopio è stato utilizzato per dispositivi strutturali immagine a livello sopramolecolare quali microtubuli o collagene 6. THG è generato dalla eterogeneità ottici quali interfaccia tra un mezzo acquoso e lipidi 7. THG è stato dimostrato anche per l'immagine mielina 8,9. Entrambe le tecniche possono essere implementate su un microscopio a fluorescenza a due fotoni e richiedono solo raggio laser. Tuttavia essi richiedono intensità del laser ad alta potenza (tipicamente 50mW a 860 nm per SHG 10, 25 – 50 mW a 1.180 nm per THG 9), che è deleterio in campioni di vita, e non forniscono la specificità chimico che è necessario per inequivocabilmente immagine strutture biologiche specifiche.
Chimicamente immagini selettiva può essere ottenuta da segnali di vibrazione molecolari intrinseche basate su Raman. Quando un fascio di luce colpisce la materia, i fotoni possono essere assorbiti e dispersi da atomi o molecole. La maggior parte dei fotoni sparsi avranno la stessa energia, cioè, la frequenza, come i fotoni incidenti. Questo processo è chiamato scattering di Rayleigh. Tuttavia, un piccolo numero di fotoni saranno disperse ad una frequenza ottica diversa dalla frequenza dei fotoni incidenti, cioè un processo di scattering anelastico chiamato Raman. La differenza di energia proviene dalla eccitazione di modi vibrazionali seconda struttura molecolare e ambiente. Pertanto, Raman spontanea dispersione providi di imaging chimicamente selettivo come molecole diverse hanno specifiche frequenze vibrazionali. Tuttavia è limitato a causa del suo segnale estremamente debole. Confocal microscopia Raman è stato sviluppato e fornisce risoluzione spaziale 3D, ma richiede media alta potenza ed acquisizione lungo 11. Per superare queste difficoltà, i recenti progressi nella tecnologia laser hanno permesso la nascita della microscopia vibrazionale ottica non lineare, in particolare coerente dispersione anti-Stokes Raman (CARS) 11,12,13.
Cars è un processo ottico non lineare del terzo ordine. Tre raggi laser, composto da un fascio di pompa a ω frequenza P, un fascio Stokes alla frequenza ω S e un fascio sonda (più spesso riconducibile pompa) sono focalizzati in un campione e generano un fascio di anti-Stokes a frequenza ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. Il segnale anti-Stokes può essere notevolmente migliorata quando la differenza di frequenzatra la pompa ed il Stokes travi è sintonizzata una Raman molecolare vibrazioni Ω R = (ω P – ω S). segnale CARS si basa sull'interazione multipla fotone. Esso genera pertanto un coerente ordini di grandezza più forte di Scattering Raman spontanea di segnale.
AUTO microscopio è stato dimostrato sperimentalmente da Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Migliorato poi la tecnica, utilizzando due fasci laser focalizzati femtosecondi vicino infrarosso con una lente obiettivo di alta apertura numerica, permettendo la condizione di accordo di fase di autoveicoli e evitando i due fotoni sfondo non risonante 16. CARS microscopia ha quindi emerso come un potente strumento per l'imaging cellulare e dei tessuti dal vivo, rilevando chimicamente molecole come lipidi (tramite vibrazioni CH tratto) 17,18, acqua (attraverso OH tratto vibrazioni), proteine, DNA nelle cellule vive 19,20 ma anche deuterato composto chimicos per farmaceutiche 21 e applicazioni cosmetiche 22.
La maggiore limitazione della microscopia non lineare deriva dalla complessità e il costo delle sorgenti ottiche. Un sistema AUTO richiede due laser sintonizzabili lunghezza d'onda con durate di impulso breve e con treni di impulsi temporalmente e spazialmente sincronizzati. Automobili in anticipo microscopi erano basati su due picosecondo sincronizzato Ti: zaffiro laser 20. AUTOMOBILI di imaging è stato ottenuto anche da un singolo femtosecondi laser Ti: zaffiro generare una fonte di luce supercontinuo 23. Recentemente, sorgenti laser composti da un unico femtosecondi laser Ti: zaffiro pompare un sintonizzabile ottici oscillatori parametrici (OPO) sono stati utilizzati per la microscopia AUTOMOBILI. Questa configurazione permette intrinsecamente temporalmente sincronizzato travi con una differenza di frequenza tra la pompa e il fascio Stokes copre l'intero spettro vibrazionale molecolare 24. Inoltre, microscopi a scansione laser basata su un fatturatoKEY Laser FS e un OPO, utilizzato principalmente per due fotoni di fluorescenza (TPF) sono ora disponibili per i non-fisici. Il potenziale di questi set-up può essere notevolmente migliorata senza richiedere investimenti supplementari per l'incorporazione di altri imaging ottico non lineare, dal momento che ogni non lineare (NLO) modalità di imaging è sensibile alle strutture o molecole specifiche. L'imaging multimodale NLO sfrutta quindi il potenziale di NLO microscopia per i campioni biologici complessi 25. L'accoppiamento di queste tecniche ha permesso l'indagine di molte questioni biologiche, in particolare sul metabolismo lipidico, pelle o cancro di sviluppo 26, lo sviluppo muscolare scheletrico 27, 28 lesioni aterosclerotiche. Inoltre, l'implementazione di scansione a raggio laser con CARS dà la possibilità di imaging ad alta frequenza, cioè, uno strumento attraente per studiare processi dinamici in vivo.
Lo scopo di questo lavoro è quello di mostrare ogni passo per implementare ttecnica che CARS su un microscopio a scansione laser multifotonica standard. Il microscopio è basato su Ti fsec: laser zaffiro ed un OPO (pompato dal Ti: zaffiro laser) azionato da un software per biologi. L'integrazione è stata effettuata regolando la lunghezza di uno dei percorso del raggio laser per sincronizzare nel tempo i due fasci. Descriviamo l'implementazione passo-passo di questa tecnica, che richiede soltanto background basic in ottica sperimentali. Illustriamo anche CARS Imaging ottenuti su guaine mieliniche del nervo sciatico di roditori, e mostriamo questo l'imaging può essere eseguito simultaneamente con altri imaging ottico non lineare, come ad esempio la tecnica della fluorescenza a due fotoni di serie e di seconda armonica generazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
La parte più impegnativa del lavoro è la sincronizzazione temporale dei raggi laser. Richiede un fotodiodo veloce combinato con un oscilloscopio veloce, ma solo una sovrapposizione ruvida nel tempo può essere eseguita in un primo momento. Poi è necessario un ulteriore aggiustamento di pochi cm. Infine, micrometro si muove da una fase di traslazione lineare permette di eseguire la regolazione fine definitiva della lunghezza della linea di ritardo al fine di innescare il segnale AUTO. Questo segnale viene mantenuto in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
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