Implementering av en sammenhengende Anti-Stokes Raman Spredning (CARS) System på en Ti: Sapphire og OPO Laser Basert Standard Laser Scanning Microscope
Summary
Sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) mikroskopi basert på iboende vibrasjoner i molekylet obligasjoner tillater label-fri kjemisk selektiv levende celle bildebehandling. Dette arbeidet viser gjennomføring av en komplementær mikroskopi teknikk på en standard multiphoton laser scanning mikroskop basert på en femtosecond Ti: safir laser og en OPO laser.
Abstract
Laserskanning mikroskoper kombinerer en femtosecond Ti: safir laser og en optisk parametrisk oscillator (OPO) å duplisere laserlinjen har blitt tilgjengelig for biologer. Disse systemene er primært konstruert for multi-kanal to-foton fluorescens mikroskopi. Men uten noen endring, komplementær ikke-lineære optiske mikroskopi som andre-harmonisk generasjon (SHG) eller tredje harmoniske generasjon (THG) kan også utføres med dette oppsettet, slik at etiketten fritt avbildning av strukturerte molekyler eller vandig mellom lipid grensesnitt. Disse teknikkene er godt egnet for in-vivo observasjon, men er begrenset i kjemisk spesifisitet. Kjemisk selektiv bilde kan fås fra iboende vibrasjonssignalene basert på Raman spredning. Confocal Raman mikroskopi gir 3D romlig oppløsning, men det krever høy gjennomsnittlig effekt og lang fangsten. For å overvinne disse vanskelighetene har nylige fremskritt i laser-teknologi tillot utviklling av ikke-lineære optiske vibrasjonsmikroskopi, spesielt sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS). CARS mikroskopi har derfor dukket opp som et kraftig verktøy for biologisk og levende celle bildebehandling, ved kjemisk kartlegging lipider (via CH strekning vibrasjon), vann (via OH strekke vibrasjoner), proteiner eller DNA. I dette arbeidet vil vi beskrive gjennomføringen av CARS teknikken på en standard OPO-coupled multiphoton laser scanning mikroskop. Den er basert på den i-tidssynkroniseringen av de to laserlinjer ved å justere lengden av en av laserstrålens bane. Vi presenterer en trinn-for-trinn gjennomføringen av denne teknikken på et eksisterende system multiphoton. En grunnleggende bakgrunn i eksperimentell optikk er nyttig og presenterte systemet krever ikke dyrt tilleggsutstyr. Vi illustrerer også CARS tenkelig innhentet på myelin hylser av isjiasnerven av gnagere, og vi viser at dette bilde kan utføres samtidig med andre ikke-lineære optiske bildediagnostikk, som for eksempel standard two-foton fluorescens teknikk og andre-harmonisk generering.
Introduction
Optisk mikroskopi har blitt en stor teknikk for ikke-destruktiv visualisering av dynamiske prosesser i levende biologiske systemer med en subcellulære oppløsning. Fluorescens mikroskopi er for tiden den mest populære bildekontrast anvendes i levende celler på grunn av sin høye spesifisitet og sensitivitet 1. En stor palett av fluorescerende prober har dukket opp (eksogene fargestoffer, genetisk kodet proteiner, halvledernanopartikler). Ulike prøve belysning fluorescerende baserte teknikker har blomstret (slik som confocal eller to-foton mikroskopi) til å utføre 3D bildebehandling og for å redusere en største ulempen med denne teknikken som er fotobleking to. Andre begrensninger inkluderer kravet om fluoroforen merking fordi de fleste av molekylære arter er ikke ubetinget fluorescerende og derfor disse fluoroforer må være kunstig innført i den avbildede prøven. Dette kunstig manipulasjon kan være forstyrrende, spesielt for små molekyler eller induserer pottenential foto-toksisitet. Disse grunner gjør fluorescens-mikroskopi ikke godt egnet for in-vivo-observasjoner. Derfor er bruken av optiske avbildningsteknikker med høy følsomhet og spesifikke molekylære kontraster uten bruk av fluorescerende molekyler meget ønskelig i biomedisinsk forskning.
Flere ikke-lineære optiske avbildningsteknikker uten merking eller flekker har dukket opp, inkludert andre-harmonisk generasjon (SHG) 3,4 og tredje harmoniske generasjon (THG) 5. SHG mikroskopi har blitt brukt til bildestrukturordninger på det supra nivå som mikrotubuler eller kollagen 6. THG er generert fra optiske heterogeniteter slik som grensesnitt mellom et vandig medium og lipider 7. THG ble også demonstrert til bilde myelin 8,9. Begge teknikkene kan implementeres på en to-foton fluorescens mikroskop og krever bare en laserstråle. Men de krever høyenergi lasere i intensitet (typisk 50mW ved 860 nm for SHG 10, 25 – 50 mW ved 1180 nm for THG 9), som er skadelig i levende prøver, og gir ikke den kjemiske spesifisitet som er nødvendig for å entydig bilde spesifikke biologiske strukturer.
Kjemisk selektiv bilde kan fås fra iboende molekylære vibrasjonssignalene basert på Raman spredning. Når en lysstråle treffer materie kan fotoner absorberes og spres av atomer eller molekyler. De fleste av de spredte fotoner vil ha samme energi, dvs. frekvens, som de innfallende fotoner. Denne prosessen kalles Rayleigh-spredning. Imidlertid vil et lite antall fotoner bli spredt ved en optisk frekvens forskjellig fra frekvensen for de innfallende fotoner, dvs. med en uelastisk spredende prosess som kalles Raman-spredning. Forskjellen i energi stammer fra eksitering av vibrasjonsmodi avhengig av molekylstrukturen og miljø. Derfor spontan Raman spredning provides kjemisk selektiv bilde som forskjellige molekyler har spesifikke vibrasjonsfrekvenser. Men det er begrenset på grunn av sin ekstremt svakt signal. Confocal Raman mikroskopi har blitt utviklet og gir 3D romlig oppløsning, men det krever høy gjennomsnittlig effekt og lang oppkjøpet tid 11. For å overvinne disse vanskelighetene, har de siste fremskritt innen laserteknologi tillot fremveksten av ikke-lineære optiske vibrasjonsmikroskopi, spesielt sammenhengende anti-Stokes Raman spredning (CARS) 11,12,13.
CARS er et tredje-ordens lineære optiske prosess. Tre laserstråler, bestående av en pumpestråle ved frekvensen ω P, er en Stokes-strålen mot frekvens ω S og en sondestråle (som oftest er den pumpe) fokusert i en prøve og generere et anti-Stokes-strålen mot frekvens ω AS = ( 2ω P – ω S) 14. Den anti-Stokes-signalet kan bli betydelig forbedret når frekvensforskjellenmellom pumpen og den Stokes bjelker er innstilt på en Raman molekyl vibrasjon Ω R = (ω P – ω S). CARS signal er basert på multiple foton interaksjon. Det genererer derfor et sammenhengende signal størrelsesordener sterkere enn spontan Raman spredning.
CARS mikroskopi ble først eksperimentelt demonstrert av Duncan et al. 15. Zumbusch et al. Forbedret da teknikken, ved hjelp av to fokusert nær-infrarød femtosecond laserstråler med en objektiv av høy numerisk apertur at fasetilpasning tilstanden på biler og unngå to-foton ikke-resonant bakgrunn 16. CARS Mikroskopi har derfor dukket opp som et kraftig verktøy for levende celle og vev avbildning, ved kjemisk å detektere molekyler slik som lipider (via CH strekning vibrasjon) 17,18, vann (via OH elastiske vibrasjoner), proteiner, DNA i levende celler 19,20 men også deuterert kjemisk forbindelses for farmasøytiske 21 og kosmetiske applikasjoner 22.
Den store begrensning av ikke-lineær mikroskopi stammer fra kompleksiteten og kostnadene av de optiske kilder. En CARS system krever to bølgelengde tunbare lasere med korte pulsvarighetene og med tid og rom synkroniserte pulstogene. Tidlige CARS mikroskoper var basert på to synkronisert picosecond Ti: safir lasere 20. CARS avbildning ble også oppnådd fra en enkelt femtosecond Ti: safir laser generere et supercontinuum lyskilde 23. Nylig, laserkilder består av en enkelt femtosecond Ti: har safir laser pumping en fleksibel optiske para oscillatorer (OPO) blitt brukt for CARS mikroskopi. Dette oppsettet gjør det mulig å egentidsmessig synkronisert bjelker med en forskjell i frekvens mellom pumpen og den Stokes strålen dekker hele molekylære vibrasjonsspektrum 24. I tillegg laser scanning mikroskop basert på en omsetningNøkkelen fs laser og en OPO, først og fremst brukt for to-foton fluorescens (TPF) er nå tilgjengelig for ikke-fysikere. Potensialet av slike oppsett kan bli betydelig forbedret uten å kreve tilleggskostnader ved innlemmelse av andre ikke-lineært optisk avbildning, siden hver ikke-lineær (NLO) avbildingsmodalitet er følsom for spesifikke strukturer eller molekyler. Multimodal NLO bildebehandling kapitaliserer derfor potensialet i NLO mikroskopi for komplekse biologiske prøver 25. Koblingen av disse teknikkene har tillatt etterforskningen av mange biologiske spørsmål, særlig på lipidmetabolismen, hud eller kreftutvikling 26, skjelettmuskelutvikling 27, aterosklerotiske lesjoner 28. Videre gjennomføring av laserstråleskanning med CARS gir mulighet for høy hastighet bildebehandling, dvs. et attraktivt verktøy for å studere dynamiske prosesser in vivo.
Målet med dette arbeidet er å vise hvert trinn å gjennomføre than CARS teknikk på en standard multiphoton laser scanning mikroskop. Mikroskopet er basert på en fsec Ti: safir laser og en OPO (pumpet av Ti: safir laser) som drives av en programvare for biologer. Integreringen ble utført ved å justere lengden av en av laserstrålens bane for å synkronisere klokken de to stråler. Vi beskriver den trinnvise gjennomføring av denne teknikk som krever at bare grunnleggende bakgrunn i eksperimentelle optikk. Vi illustrerer også CARS Imaging innhentet på myelin hylser av isjiasnerven av gnagere, og vi viser dette bildebehandling kan utføres samtidig med andre ikke-lineære optiske bildediagnostikk, slik som standard to-foton fluorescens teknikk og andre-harmonisk generasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest utfordrende delen av arbeidet er tidsmessig synkronisering av laserstråler. Det krever en rask fotodiode kombinert med en rask oscilloskop, men bare en grov overlappende i tid kan bli utført til å begynne med. Deretter en ytterligere justering av noen få cm kreves. Endelig mikrometer trekk ved en lineær oversettelse scenen lar utføre den endelige finjustering av forsinkelsen linjelengde for å utløse CARS signal. Dette signal opprettholdes i et smalt område på rundt 20 um, som observert ved å justere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors want to thank Dr. Philippe Combette (IES, UM, Montpellier, France) for the loan of the fast oscilloscope and acknowledge financial supports from Montpellier RIO Imaging (MRI). HR acknowledges ANR grants France Bio Imaging (ANR-10-INSB-04-01) and France Life Imaging (ANR-11-INSB-0006) infrastructure networks for coherent Raman imaging developments. This work was mainly supported by an European Research Council grant (FP7-IDEAS-ERC 311610) and an INSERM – AVENIR grant to NT.
Materials
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 520D | 500 MHz |
| Photodetector | Thorlabs | DET08C/M, T4290 | 5 GHz InGaAs, 800-1700 nm |
| Ti:Sapphire laser Chameleon Ultra Family II | Coherent | ||
| Optical parametric oscillator OPO Compact Family | APE Berlin | ||
| Axio Examiner microscope LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Motorized periscope | Newport | ||
| Objective W Plan-Apochromat 20x/1.0 | Carl Zeiss | ||
| Beam combiner | Carl Zeiss | ||
| Acousto-optic modulator | Carl Zeiss | ||
| OPO power attenuator | Carl Zeiss | ||
| Photomultiplier tube | Carl Zeiss | ||
| ZEN software | Carl Zeiss | ||
| Bandpass filters | Carl Zeiss | LSM BiG 1935-176 | 400-480 nm ; 500-550 nm ; 465-610 nm |
| Dichroic mirror | Carl Zeiss | Cutoff wavelength 760 nm | |
| Silver mirrors | Newport | 10D20ER.2 | λ/10, 480-20,000 nm , Quantity 4 |
| Single-axis translation stage with standard micrometer | Thorlabs | PT1/M | Quantity 1 |
| Aluminium breadboard | Thorlabs | MB1015/M | Quantity 1 |
| Mirror mount | Thorlabs | KMSS/M | Quantity 4 |
| Mirror holder for Ø1" Optics | Thorlabs | MH25 | Quantity 4 |
| Iris diaphragms | Thorlabs | ID8/M | Quantity 3 |
| Protective box | Thorlabs | TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S | Quantity 1 |
| Optical posts | Thorlabs | TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M | Quantity 8 (lengths depending on the set-up) |
| 661-690 nm bandpass filter | Semrock | 676/29 nm BrightLine® single-band bandpass filter | Quantity 1 |
| Fluorescent beads | ThermoFisher | TetraSpeck™ Fluorescent Microspheres Size Kit | |
| Laser viewing card | Thorlabs | IR laser viewing card | |
| Laser safety glass | Newport | LV-F22.P5L07 | |
| FluoroMyelin™ Red Fluorescent Myelin Stain | ThermoFisher | F34652 |
References
- Valeur, B., Berberan-Santos, M. N. . Molecular Fluorescence: Principles and Applications. , (2012).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Moreaux, L., Sandre, O., Mertz, J. Membrane imaging by second-harmonic generation microscopy. JOSA B. 17 (10), 1685-1694 (2000).
- Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (17), 11014-11019 (2002).
- Yelin, D., Silberberg, Y. Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology. Opt. Express. 5 (8), 169-175 (1999).
- Campagnola, P. J., Millard, A. C., Terasaki, M., Hoppe, P. E., Malone, C. J., Mohler, W. A. Three-dimensional high-resolution Second-Harmonic Generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys. J. 81 (1), 493-508 (2002).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy. Biophys. J. 100 (5), 1362-1371 (2011).
- Lim, H., Sharoukhov, D., Kassim, L., Zhang, Y., Salzer, J. L., Melendez-Vasquez, C. V. Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (50), 18025-18030 (2014).
- Strupler, M., Pena, A. M., Hernest, M., Tharaux, P. L., Martin, J. L., Beaurepaire, E., Schanne-Klein, M. C. Second harmonic imaging and scoring of collagen in fibrotic tissues. Opt. Express. 15 (7), 4054-4065 (2007).
- Cheng, J. X., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: Instrumentation, theory, and applications. J. Phys. Chem. B. 108 (3), 827-840 (2004).
- Volkmer, A. Vibrational imaging and microspectroscopies based on coherent anti-Stokes scattering microscopy. J. Phys. D: Appl. Phys. 38, R59-R81 (2005).
- Evans, C. L., Xie, X. S. Coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy: chemical imaging for biology and medicine. Annu. Rev. Anal. Chem. 1, 883-909 (2008).
- Mukamel, S. . Principles of nonlinear optical spectroscopy. , (1995).
- Duncan, M. D., Reintjes, J., Manuccia, T. J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope. Opt. Lett. 7 (8), 350-352 (1982).
- Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys. Rev. Lett. 82 (20), 4142-4145 (1999).
- Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr. Opin. Genet. Dev. 21 (5), 585-590 (2011).
- Wang, P., Liu, B., Zhang, D., Belew, M. Y., Tissenbaum, H. A., Cheng, J. X. Imaging lipid metabolism in live Caenorhabditis elegans using fingerprint vibrations. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 53 (44), 11787-11792 (2014).
- Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).
- Cheng, J. X., Jia, Y. K., Zheng, G., Xie, X. S. Laser-scanning coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy and applications to cell biology. Biophys J. 83 (1), 502-509 (2002).
- Chiu, W. S., Belsey, N. A. N., Garrett, L., Moger, J., Delgado-Charro, M. B., Guy, R. H. Molecular diffusion in the human nail measured by stimulated Raman scattering microscopy. Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, 7725-7730 (2015).
- Chen, X., Grégoire, S., Formanek, F., Galey, J. -. B., Rigneault, H. Quantitative 3D molecular cutaneous absorption in human skin using label free nonlinear microscopy. J. of Control. Release. 200, 78-86 (2015).
- Kano, H., Hamaguchi, H. In vivo multi-nonlinear optical imaging of a living cell using a supercontinuum light source generated from a photonic crystal fiber. Opt. Express. 14 (7), 2798-2804 (2006).
- Brustlein, S., Ferrand, P., Walther, N., Brasselet, S., Billaudeau, C., Marguet, D., Rigneault, H. Optical parametric oscillator-based light source for coherent Raman scattering microscopy: practical overview. J. Biomed. Opt. 16 (2), 021106 (2011).
- Chen, H., et al. A multimodal platform for nonlinear optical microscopy and microspectroscopy. Opt. Express. 17 (3), 1282-1290 (2009).
- Yue, S., Slipchenko, M. N., Cheng, J. X. Multimodal nonlinear optical microscopy. Laser Photonics Rev. 5 (4), 496-512 (2011).
- Sun, Q., Li, Y., He, S., Situ, C., Wu, Z., Qu, J. Y. Label-free multimodal nonlinear optical microscopy reveals fundamental insights of skeletal muscle development. Biomed Opt Express. 5 (1), 158-166 (2013).
- Le, T. T., Langohr, I. M., Locker, M. J., Sturek, M., Cheng, J. X. Label-free molecular imaging of atherosclerotic lesions using multimodal nonlinear optical microscopy. J. Biomed. Opt. 12 (5), 054007 (2007).
- Ellis, D. I., Cowcher, D. P., Ashton, L., O’Hagana, S., Goodacre, R. Illuminating disease and enlightening biomedicine: Raman spectroscopy as a diagnostic tool. Analyst. 138, 3871-3884 (2013).
- Ozçelik, M., et al. Pals1 is a major regulator of the epithelial-like polarization and the extension of the myelin sheath in peripheral nerves. J Neurosci. 30 (11), 4120-4131 (2010).
- Heinrich, C., Hofer, A., Ritsch, A., Ciardi, C., Bernet, S., Ritsch-Marte, M. Selective imaging of saturated and unsaturated lipids by wide-field CARS-microscopy. Opt. Express. 16 (4), 2699-2708 (2008).
- Kyriakidis, N. B., Skarkalis, P. Fluorescence spectra measurement of olive oil and other vegetable oils. J. AOAC Int. 83 (6), 1435-1439 (2000).
- King, R. Microscopic anatomy: normal structure. Handb. Clin. Neurol. 115, 7-27 (2013).
- Monsma, P. C., Brown, A. FluoroMyelin Red is a bright, photostable and non-toxic fluorescent stain for live imaging of myelin. J. Neurosci. Methods. 209 (2), 344-350 (2012).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys. J. 89 (1), 581-591 (2005).
- Wang, H. W., Fu, Y., Huff, T. B., Le, T. T., Wang, H., Cheng, J. X. Chasing lipids in health and diseases by coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy. Vib. Spectrosc. 50 (1), 160-167 (2009).
- Jung, Y., Tam, J., Jalian, H. R., Anderson, R. R., Evans, C. L. Longitudinal, 3D in vivo imaging of sebaceous glands by coherent anti-stokes Raman scattering microscopy: normal function and response to cryotherapy. J. Invest. Dermatol. 135 (1), 39-44 (2015).
